蚓激酶对鼠局灶性脑缺血再灌注损伤的保护作用

山西省长治钢铁集团公司职工总医院 （046031） 李青兰 李玲 亢春生

山西省长治医学院 （046000） 来利娜

蚓激酶是从特种蚯蚓中提取的一组蛋白水解酶，是一种多酶制剂，具有降低纤维蛋白原含量，降低血小板聚集率，增强纤溶系统活性，改善内皮细胞功能，常用于缺血性脑卒中、心肌梗死等血栓性疾病的治疗和康复。本实验通过线栓动脉法制备大鼠脑局灶缺血再灌注模型，观察蚓激酶对大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤的保护作用，通过检测血浆中PGI2的稳定代谢产物6-keto-PGF1α和 TXA2的稳定代谢产物TXB2水平，探讨其作用机制，为临床用药提供一定的科学依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物 健康Wistar大鼠，体重220±20g，雌雄兼用（由山西医科大学实验动物中心提供）。

1.2 药品及试剂 蚓激酶（北京百奥药业有限责任公司，国药准字H110211129）。复方丹参注射液（黄山市天目药业有限公司，批号：050601）。TXB2、6-Keto-PGF1α放免测定试剂盒（北京东亚免疫技术研究所，批号：060113）。

1.3 方法

1.3.1 分组 大鼠随机分为蚓激酶组、复方丹参注射液组、模型组、假手术组。其中，蚓激酶组灌胃（60万单位，tid，连续5天）；复方丹参组预先连续尾静脉注射给药，100mg/kg每天1次，连续5d，再灌注6h、12h时给药2次；模型组和假手术组大鼠注射生理盐水，给药时间及体表面积同前。

1.3.2 大鼠局灶性脑缺血再灌注模型的建立 以10%水合氯醛0.3ml/100g腹腔麻醉，参照Longa等[1]的方法并加以改进，制备左侧大脑中动脉阻塞（MCAO）模型。颈正中做约1.5cm皮肤切口，暴露左侧颈总动脉（CCA）、颈外动脉（ECA）及颈内动脉（ICA），结扎ECA，将头端用石蜡包被的尼龙鱼线通过CCA切口处插入ICA，插线长度自CCA分叉处约18mm～20mm（据动物体重而定），阻断左侧大脑中动脉血流，然后缝合皮肤，栓线尾端部分固定于皮肤上。于缺血2h后，抽出尼龙鱼线予以再灌注24h。假手术组中，大鼠只分离出CCA、ECA和ICA，不结扎任何动脉及插线。

1.3.3 神经行为缺陷评分 大鼠在脑缺血2h再灌注24h后对动物进行行为评分。0分：无神经功能缺失症状；1分：提大鼠尾，见瘫痪侧前肢回收屈曲不能正常伸向地面；2分：推瘫痪侧时感阻力较对侧明显降低；3分：大鼠爬行时向瘫痪侧旋转；4分：伴有意识障碍。分数越高，则动物的行为障碍越严重。

1.3.4 脑梗塞范围测定 在缺血2h再灌注24h后，每组取8只动物，断头取脑，剔除嗅脑、低位脑干及小脑，称重后置于-20℃低温冰箱快速冷冻30min后，将脑组织做冠状切片，厚度约为2mm。脑片置于1%TTC溶液中，37℃避光孵育30min。经染色后，正常脑组织呈玫瑰红色，而脑梗塞区呈苍白色，待显色完全后置50%甲醛溶液中固定24小时。仔细分离苍白区和非苍白区，分别称重，计算梗塞范围。

1.3.5 脑组织含水量测定[2]每组取8只动物，切取大脑前极到视交叉处的脑片，分别称量左脑片湿重；105℃烘干至恒重，即干重。按下列公式计算脑含水量，脑含水量(%)=[脑湿重(g)-脑干重(g)]/脑湿重(g)×100%。

1.3.6 血浆中6-keto-PGF1α和TXB2的测定断头取脑的同时，取血3m1于EDTA抗凝离心管中混匀，4℃离心15 min（3500 r/min），分离血浆，放置于-20℃保存。而后按放免试剂盒说明，自动γ计数器预先编程，直接测出样品浓度。

2 结果

2.1 对大鼠行为障碍的影响 局灶性脑缺血再灌注后，除假手术组外，所有动物出现不同程度的神经运动功能障碍，模型组尤为明显，主要表现为跛行和手术对侧瘫痪。经蚓激酶及复方丹参注射液治疗后，脑缺血大鼠的行为障碍有不同程度的改善，结果见附表1。

2.2 对大鼠脑梗塞范围的影响 假手术组大鼠脑组织呈均匀一致的玫瑰红色，无缺血梗死灶，其他各组大鼠大脑皮质均出现苍白色的梗死灶。与模型组相比，复方丹参注射液组及蚓激酶组明显缩小局灶性脑缺血大鼠的脑梗塞面积，结果见附表1。

2.3 对局灶性脑缺血再灌注大鼠脑组织含水量的影响 与假手术组相比，其他各组病灶侧半球含水量明显增加，复方丹参注射液及蚓激酶组脑水肿程度较模型组明显减轻，结果见附表1。

2.4 血浆中6-keto-PGF1α和TXB2的水平 与假手术组相比，脑缺血再灌注模型组大鼠血浆中TXB2及 TXB2/6-keto-PGF1α（T/P）明显升高。与模型组比较，蚓激酶组和复方丹参注射液组TXB2及T/P值均明显降低，而6-keto-PGF1α则明显高于模型对照组，结果见附表2。

3 讨论

在急性脑血管病中，缺血性脑血管疾病占50%～70%，近年来发现发病48h内，绝大多数病人的缺血皮质已发生了再灌注。众所周知，脑缺血后的再灌注是神经功能恢复的基本条件，也是脑组织损伤加重的重要因素。

蚓激酶具有纤溶酶原激活物的作用，且能与纤维蛋白结合使其迅速降解，抗血小板聚集、改善血管内皮细胞功能，改善微循环和抑制血栓形成等作用[3]。

附表1 蚓激酶对局灶性脑缺血再灌注损伤大鼠行为障碍、脑梗塞范围、脑组织含水量影响

附表2 蚓激酶对鼠局灶性脑缺血再灌注损伤血浆TBX2和6-keto-PGF1α及T/P影响

本研究结果显示，蚓激酶能明显减轻脑水肿、缩小梗塞面积和改善运动功能，显示出良好的脑组织保护作用。

脑缺血再灌注损伤的病理生理是一个酶促级联反应，血栓素与前列腺素系统失衡是其发生机制之一。PGI2和TXA2均为花生四烯酸的代谢产物。在正常情况下，PGI2和TXA2保持着动态平衡以维持对血管及供血的调节，而病理状态下，花生四烯酸代谢异常，导致PGI2和TXA2的比例失调，血小板合成TXA2增多，血管内皮细胞生成PGI2受抑制，血小板呈现高凝状态，微血管收缩性增强等，导致低灌流，加重缺血组织的损伤。

测定PGI2的稳定代谢产物6-keto-PGF1α和 TXA2的稳定代谢产物TXB2作为指标。本实验表明，TXB2及T/P值明显升高（P＜0.01），而蚓激酶组能抑制脑缺血再灌注模型大鼠血浆中TXB2的生成，同时增加6-keto-PGF1α在血浆中的含量，使T/P比值降低，故认为蚓激酶有良好的脑组织保护作用，增强纤溶系统活性，抑制血小板聚集，减慢TXA2合成，改善血管内皮细胞功能，升高PGI2，降低T/P是其对大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤保护机制之一。