黄秋葵多糖的提取、分离及其体外结合胆酸盐能力的分析

任丹丹，陈 谷*

(华南理工大学轻工与食品学院，广东 广州 510640)

黄秋葵多糖的提取、分离及其体外结合胆酸盐能力的分析

任丹丹，陈 谷*

(华南理工大学轻工与食品学院，广东 广州 510640)

探讨黄秋葵结合胆酸的有效组分的分离纯化，通过水提醇沉提取黄秋葵粗多糖(raw polysaccharide，RPS)，经DEAE-纤维素阴离子交换层析柱分离得到3种多糖洗脱组分E1、E2和E3；对3种组分的体外结合胆酸能力进行分析。结果显示：组分E1和E2有较高的胆酸结合能力，分别为参照药物消胆胺的10.82%和10.60%，黄秋葵多糖体外结合胆酸作用较强。

黄秋葵；多糖；醇沉；阴离子交换层析；胆酸结合

Abstract：In order to investigate active components having the ability to bind bile acid from okra,Abelmoschus esculentus(L.)Moench, raw polysaccharide (RPS) was obtained from the fresh fruits of okra by water extraction and ethanol precipitation.RPS was further purified by DEAE anion exchange chromatography to obtain fractions E1, E2 and E3. Their bile acid-binding capacitiesin vitrowere determined. The results indicated that fractions E1 and E2 presented different bile acid binding capacities,which accounted for 10.82% and 10.60% of that of cholestyramine, respectively. These investigations provide some significant references for exploring and developing okra as health food or functional additives.

Key words：okra；polysaccharide；ethanol precipitation；anion exchange chromatography；bile acid binding capacity

2007年，中国卫生部心血管病防治研究中心推出《中国成人血脂异常防治指南》，呼吁大家重视血脂问题，指出血脂异常已经成为我国居民的一个重要公共卫生问题。血脂异常是导致冠心病、心肌梗死、心脏猝死等疾病的危险因素，它通过加速全身动脉粥样硬化，对身体造成隐匿、逐进性、全身性和器质性的损害。然而，我国目前的血脂异常患者多是轻、中度血脂异常的中、低危人群，并不需要通过药物降脂。因此，开发纯天然具有降脂功效的保健品，变治病为防病，越来越受人们的关注。

血脂是血液中的脂肪类物质，包括胆固醇、甘油三酯、磷脂和非游离脂肪酸等的总称。包括人类在内的哺乳动物可以将胆固醇转化为胆酸，分泌至消化道。一旦胆酸被结合并排泄出体外，将阻断胆酸的肝肠循环[1]。体内胆酸的减少，解除了胆酸对胆酸合成关键酶7α-羟化酶的反馈抑制，促使更多胆固醇生成胆酸，从而降低血清胆固醇，有利于缓解糖尿病和肥胖症等血脂异常疾病，并降低罹患癌症的风险[2-3]。

黄秋葵[Abelmoschus esculentus(L.) Moench]，又名补肾草、秋葵和羊角豆等，为锦葵科秋葵属一年生草本植物。可供食用的嫩果部分充满黏液，营养成分丰富，富含蛋白质、不饱和脂肪酸、维生素、多糖、黄酮类化合物等，是一种营养保健蔬菜[4-5]。美国人称其为“植物伟哥”，日本人称其为“绿色人参”，经常食用可增强人体体质，具有很高的开发价值和潜力。除此之外，实验证明黄秋葵的嫩果具有抗疲劳[6-7]、治疗皮肤癌[8]等功能。

1977年，Woolfe等[9]报道在动物实验中黄秋葵黏液可降低小鼠的血浆胆固醇，但机理不明。2007年，Kahlon等[10]研究了黄秋葵等多种新鲜蔬菜体外结合胆酸的能力，指出与其他蔬菜，如甜菜、芦笋、青豆等相比，黄秋葵具有较强的结合胆酸能力。同年Kahlon又报道蒸煮对黄秋葵的胆酸结合能力影响不大[11]。但是，具体黄秋葵的哪种组分能有效结合胆酸没有进一步的研究。多糖的活性研究表明其具有显著的结合胆酸、降低胆固醇的作用[12-14]。本实验通过提取分离黄秋葵多糖，分析各个组分的胆酸结合能力，为进一步确定结合胆酸有效组分、开发利用黄秋葵提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

黄秋葵购于广州蔬菜批发市场。

DEAE-纤维素 上海试剂二厂；纤维素、消胆胺、胆酸、胰酶 Sigma公司；总胆酸TBA测定试剂盒Diazyme公司；透析袋(6～8kD) 北京普博欣生物科技有限公司；无水乙醇、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、氢氧化钠、苯酚(重蒸)、浓硫酸、氯化钠等均为国产分析纯试剂。

1.2 仪器与设备

EYELA真空旋转蒸发器 上海爱朗仪器有限公司；冷冻干燥机 美国Thermo公司；台式高速离心机 美国贝克曼公司；冷冻离心机 德国Eppendorf公司；QL-901型漩涡混合器 江苏海门其林贝尔仪器制造有限公司；HL-2B恒流泵、SBS-100数控计滴自动部份收集器上海沪西分析仪器厂有限公司；UV-2300紫外-可见分光光度计 上海天美科学仪器有限公司；HYG-A全温摇瓶柜 太仓市实验设备厂；恒温培养箱 上海索谱仪器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 多糖的分离纯化

黄秋葵干粉的制备：称取新鲜黄秋葵嫩果，蒸馏水清洗干净。将其平均分为两部分，一部分切成长约3cm小段，沸水蒸煮15min；另一部分不做处理。然后将两部分同时进行－80℃预冻，冷冻干燥，磨成粉状，密封，干燥保存。分别得到黄秋葵干粉和蒸煮干粉。

黄秋葵粗多糖(RPS)的提取[15]：采用水提醇沉法，取新鲜黄秋葵嫩果，蒸馏水清洗干净，组织捣碎机捣碎，加蒸馏水浸泡过夜，离心去除沉淀。在上清液中加无水乙醇(乙醇的终体积分数为45%)，静置过夜，离心取醇沉淀。将沉淀物真空抽滤去除残留的乙醇。加少量蒸馏水至提取物完全复溶，用大量蒸馏水透析，真空浓缩，冷冻干燥，得黄秋葵粗多糖。

DEAE-纤维素的预处理：称取30g DEAE-纤维素,蒸馏水浸泡过夜后抽滤；用0.5mol/L NaOH溶液浸泡30min，蒸馏水洗至中性；0.5mol/L HCl溶液浸泡30min，蒸馏水洗至中性；0.5mol/L NaOH溶液浸泡30min，蒸馏水洗至中性。抽真空脱气，装入层析柱(3.0cm×18cm)，用蒸馏水平衡过夜。

黄秋葵粗多糖的分离[16]：称取0.13g黄秋葵粗多糖，溶于10mL去离子水中，上DEAE-纤维素层析柱，分别用去离子水、0.25mol/L PBS(pH6.0)、0.5mol/L PBS(pH6.0)、0.5mol/L NaOH溶液洗脱。控制流速为1mL/min，自动收集器10min/管收集。用苯酚-硫酸法快速检测含糖管[17]：吸取洗脱液1mL/管于具塞试管中，每管加5g/100mL苯酚液0.5mL，边振荡边加浓硫酸2.5mL，摇匀放置5min，沸水浴中加热15min，迅速冷至室温，于490nm波长处测定吸光度，检测出含糖管，得洗脱曲线。收集同一洗脱峰的各含糖管，洗脱液经过透析，真空浓缩，冷冻干燥，得黄秋葵多糖各洗脱组分，分别为 E1、E2 和 E3。

1.3.2 体外胆酸结合实验

根据人体机理，胆酸结合的过程主要是模拟人的胃肠环境，参考Kahlon等[10]的胆酸结合研究方法，并略加修改。基于人体胃肠胆酸成分[18-19]，按体积分数配胆酸混合物，主要包含75%甘氨胆汁酸和25%牛磺胆汁酸。甘氨胆汁酸：甘氨胆酸(9mmol/L)、甘氨鹅脱氧胆酸(9mmol/L)、甘氨脱氧胆酸(9mmol/L)。牛磺胆汁酸：牛磺胆酸(3mmol/L)、牛磺鹅脱氧胆酸(3mmol/L)、牛磺脱氧胆酸(3mmol/L)。胆酸溶于0.1mol/L PBS(pH6.3)，母液浓度36mmol/L，－20℃保存，用前稀释至0.72μmol/mL。

精确称取各个样品至2mL离心管，加0.2mL 0.01mol/L HCl溶液，37℃，温育1h。用0.1mol/L NaOH溶液调节 pH 至6.3，加0.8mL 胆酸(0.72μmol/mL)、1mL 胰酶(10mg/mL)，混匀，37℃，温育1h。13000r/min离心18min，转移上清至5mL离心管。用1mL PBS(0.1mol/L，pH6.3)冲洗2mL离心管及沉淀，离心，将两次上清混合，－20℃保存，待测残留胆酸浓度。每个样品做3个平行。同时做空白样(不加样品，其他操作相同)。另外，取样品不加胆酸，用0.8mL PBS(0.1mol/L，pH6.3)代替，其他操作相同以扣除样品背景。各样品的量：黄秋葵干粉20mg、黄秋葵蒸煮干粉20mg、黄秋葵粗多糖10mg、E110mg、E210mg、E310mg、消胆胺5mg、纤维素5mg。消胆胺是一种结合胆酸的药物，纤维素不结合胆酸，分别设为阳性对照100%和阴性对照0%。

1.3.3 胆酸含量检测

经胆酸结合后的样品，使用Diazyme测量总胆酸的试剂盒检测其中胆酸含量。胆酸和试剂盒试剂反应形成甲瓒(formazan)，在540nm波长处测的吸光度与胆酸浓度成正比例。样品胆酸浓度由标准曲线来确定。标准曲线的制作：用0.1mol/L PBS(pH6.3)配制浓度分别为0、10、50、100、200μmol/L的胆酸溶液，用胆酸试剂盒测吸光度ΔA540nm；以ΔA540nm为纵坐标，胆酸浓度为横坐标得胆酸标准曲线。试剂盒方法概述如下：将R1*加至R3*中，新鲜配制R3。取150μL R3至微量比色皿，加20μL胆酸结合后样品，混匀，37℃，温育4min。加30μL R2*，混匀，立即测其540nm波长处的吸光度(A1)。样品放置37℃，温育5min，再测其 540nm 波长处的吸光度(A2)。计算样品的ΔA540nm=A2－A1。每个样品做3次测量 (R1*、R2*、R3*均为试剂盒中试剂)。

2 结果与分析

2.1 多糖的分离纯化

黄秋葵经水提醇沉，透析冻干得到粗多糖，产率约0.40%，呈黄色絮状固体。由于多糖一般为中性或酸性带负电荷，因此采用阴离子交换树脂DEAE-纤维素层析柱分离纯化黄秋葵粗多糖，分别用去离子水、0.25mol/L PBS(pH6.0)、0.5mol/L PBS(pH6.0)、0.5mol/L NaOH溶液洗脱。用苯酚-硫酸法快速检测出含糖管，得到洗脱曲线，结果见图1。收集各个洗脱峰的含糖管，经透析，冷冻干燥，得到3种不同的含糖组分，分别为E1、E2和E3。

图1 黄秋葵粗多糖的DEAE-纤维素层析柱图谱Fig.1 Elution profile of okra raw polysaccharide on DEAE-cellulose column

从图1可知，洗脱峰平滑，不同洗脱液峰和峰之间的分离效果好，达到分离目的。去离子水洗脱部分未见含糖组分；0.25mol/L PBS洗脱在18～35管之间得到洗脱组分；0.5mol/L PBS洗脱在42～60管之间得到洗脱组分；0.5mol/L NaOH溶液洗脱在67～85管之间得到洗脱组分。收集各个洗脱液的含糖管，经透析冻干后得产物E1、E2和E3，其产率分别为11.6%、22.2%和36.2%。DEAE-纤维素在分级时，可脱除粗多糖的部分色素，得到的分级组分呈浅黄色，絮状固体。

2.2 胆酸结合能力检测

胆酸在人体肝脏中合成后被分泌到消化道内，如果胆酸在肠道未被结合，就会被回肠重吸收进入肝肠循环；如果胆酸被食物结合阻碍重吸收入血液，将促使更多的胆固醇转化成胆酸，从而降低体内的胆固醇含量。在体外条件下，模拟人体胃肠环境进行胆酸结合实验，用胆酸试剂盒制作标准曲线(图2)，并检测胆酸结合后剩余胆酸的量，来分析各组分的胆酸结合能力。

图2 胆酸浓度的标准曲线Fig.2 Standard curve of bile acid

检测黄秋葵干粉、蒸煮干粉和粗多糖的胆酸结合能力，结果见表1。在相同的干质量条件下，相对于消胆胺(设为100%)，黄秋葵干粉和蒸煮干粉的胆酸结合能力分别为：11.48%和10.38%。与纤维素相比，有极显著的胆酸结合能力(P＜0.001)。蒸煮过后胆酸结合能力略有下降，但两者差异不大，表明蒸煮处理对黄秋葵的胆酸结合能力影响不大，这与Kahlon等[11]的报道相一致。在相同干质量下，黄秋葵粗多糖的胆酸结合能力为14.13%，较黄秋葵干粉和蒸煮干粉有所提高，说明粗多糖中富集了结合胆酸的有效组分。

表1 黄秋葵干粉、蒸煮干粉和粗多糖的胆酸结合能力Table 1 in vitroBile acid binding capacities of lyophilized powder,steamed-lyophilized powder and RPS from okra

对黄秋葵粗多糖用DEAE-纤维素阴离子交换层析柱分级后得到的3种组分，E1、E2和E3的胆酸结合能力进行分析，结果见表2。在相同的干质量条件下，E3组分没有结合胆酸的能力；而E1和E2组分均可结合胆酸，相对于消胆胺，结合能力分别为10.82%和10.60%，两种组分胆酸结合能力基本相同。说明经阴离子交换层析分级分离，黄秋葵粗多糖中结合胆酸的有效组分落在E1和E2组分，而E3的糖组分不具结合胆酸的有效成分。

表2 E1、E2和E3的胆酸结合能力Table 2 in vitroBile acid binding capacities of RPS and fractions E1,E2 and E3

3 讨 论

本实验用水提醇沉法提取黄秋葵粗多糖，并将粗多糖经DEAE-纤维素分级分离，得到3种不同的含糖组分，依胆酸结合实验，确定了胆酸结合能力较强的组分为E1和E2。

2004年，Lengsfeld等[16]报道，体外实验中黄秋葵的含糖组分可以抑制幽门螺旋杆菌吸附人的胃黏膜，将水提醇沉得到的粗多糖经过DEAE-Sephacel层析分级分离，发现抗吸附的有效组分落在NaOH溶液的洗脱组分。参考0.25mol/L PBS、0.5mol/L PBS和0.5mol/L NaOH洗脱组分的成分和结构分析结果，推测，本实验中E1、E2组分含大量的半乳糖醛酸，以及鼠李糖、阿拉伯糖、木糖、甘露糖、半乳糖、葡萄糖、葡萄糖醛酸等。而胆酸结合能力除了与糖成分相关外，更与多糖的复杂结构相关，具体的成分和结构有待进一步的分析。

在分离纯化胆酸结合组分的过程中，粗多糖富集了有效组分，胆酸结合能力有提高(14.13±1.21)%，但是经DEAE-纤维素分级分离后，相同干质量下E1和E2组分的胆酸结合能力反而低于黄秋葵粗多糖(10.82±0.11)%、(10.60±1.55)%。纯化过程中，E1、E2和E3含糖组分的得率分别为11.6%、22.2%和36.2%，损失了约30%的其他组分，估计大部分是洗脱在不含糖的各管洗脱收集液中。有报道，蛋白质可以结合胆酸[20-21]；黄秋葵粗多糖含数种分子质量介于25～37kD的糖蛋白，而经DEAE层析后蛋白组分基本去除[16]。故推测黄秋葵粗多糖含有结合胆酸的蛋白成分，但在DEAE分级分离中被除去，导致胆酸结合能力下降。也可能，粗多糖中较高的胆酸结合能力是源于糖蛋白与多糖形成复杂的三维结构，有利于结合胆酸，而在DEAE层析分离过程中被破坏。真实的情况有待进一步研究。另外，多糖之间的协同效应也可能是造成纯化组分的胆酸结合能力有所下降的原因，进一步的实验正在进行中。

在体外模拟人体胃肠环境结合胆酸，并用试剂盒检测残留胆酸的量，是从化学反应的角度描述黄秋葵的胆酸结合能力。结果显示多糖提取组分有明显的胆酸结合能力，但是否会促进体内胆固醇含量的降低还要经动物实验来证明，然而动物实验存在费用高、实验周期长和社会道德等问题。在人体肝脏内胆固醇转化为胆酸过程中有多种酶的参与，其中胆固醇7α-羟化酶(CYP7A1)被认为是该反应的关键酶，胆酸反馈抑制CYP7A1基因的转录表达[22]。因此，我们正在建立介于简单的化学反应和复杂的动物模型之间的三维细胞培养模型，通过CYP7A1启动子引导的绿色荧光蛋白报告基因表达情况来反映CYP7A1的表达量，实现快速高通量的筛选提高CYP7A1表达、促进胆固醇转化的生物活性分子或健康食品。

[1] ANDERSON J W, SIESEL A E. Hypercholesterolemia effects of oat products[J]. Advances in Experimental Medicine and Biology, 1990,270:17-36.

[2] KOBAYASHI M, IKEGAMI H, FUJISAWA T, et al. Prevention and treatment of obesity, insulin resistance, and diabetes by bile acid-binding resin[J]. Diabetes, 2007, 56:239-247.

[3] COSTARELLI V, KEY T J, APPLEBY P N, et al. A prospective study of serum bile acid concentrations and colorectal cancer risk in postmenopausal women on the island of Guernsey[J]. British Journal of Cancer, 2002, 86(11):1741-1744.

[4] 覃世成. 药食兼用保健蔬菜:黄秋葵[J]. 农业新技术, 2003, 4(4):195.

[5] SAVELLO P A, MARTINS F, HULL W. Nutrition composition of okra seed meals[J]. Journals of Agricultural and Food Chemistry, 1980, 28(6):1163-1166.

[6] 李建华, 陈珊. 黄秋葵水提液抗疲劳的药效学观察[J]. 中国运动医药学杂志, 2004, 23(2):196-197.

[7] 王君耀, 周峻, 汤谷平. 黄秋葵抗疲劳作用的研究[J]. 中国现代应用药学杂志, 2003, 20(4):316-317.

[8] 张忠堤. 秋葵用湿润暴露疗法治疗烧(烫)伤73例报告[J]. 现代医药卫生, 1995, 11(增刊1):75-76.

[9] WOOLFE J A. The effect of okra mucilage (Hibiscus esculentusL.) on the plasma cholesterol level in rats[J]. Proceedings of the Nutrituion Society, 1977, 36(2):59A.

[10] KAHLON T S, CHAPMAN M H, SMITH G E.In vitrobinding of bile acids by okra, beets, asparagus, eggplant, turnips, green beans, carrots,and cauliflower[J]. Food Chemistry, 2007, 103:676-680.

[11] KAHLON T S, CHIU M C, CHAPMAN M H. Steam cooking significantly improvesin vitrobile acid binding of beets, eggplant, asparagus,carrots, green beans, and cauliflower[J]. Nutrition Research, 2007, 27:750-755.

[12] 衣艳君. 枸杞降血脂作用的实验研究[J]. 首都师范大学学报, 2000,21(4):68-70.

[13] 季丽娜, 陈葆春, 刘洪德, 等. 北虫草制品免疫功能、调节血脂和抗疲劳功能与营养的实验研究[J]. 实用预防医学, 2002, 9(2):178-179.

[14] 廖建民, 沈子龙, 张瑾. 海带多糖中不同组分降血脂及抗肿瘤作用的研究[J]. 中国药科大学学报, 2002, 33(1):55-57.

[15] 王文平, 郭汜远, 李琳, 等. 野木瓜水溶性多糖的提取、分离及结构分析[J].华南理工大学学报, 2008, 36(7):128-132.

[16] LENGSFELD C, TITGEMEYER F, FALLER G, et al. Glycosylated compounds from okra inhibit ashesion of helicobacter pylori to human gastric mucosa[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2004,52(6):1459-1503.

[17] 佘晓雷, 张可, 郑旭霞. 芦荟中多糖含量测定方法的探讨[J]. 营养学报, 2003, 25(2):149-152.

[18] CAREY M C, SMALL D M. The characteristics of mixed micellar solutions with particular references to bile[J]. American Journal of Medcine,1970, 49:590-608.

[19] ROSSI S S, CONVERSE J L, HOFFMAN A F. High pressure liquid chromatography analysis of conjugated bile acids in human bile:simultaneous resolution of sulfated and unsulfated lithocholyl amidates and the common conjugated bile acids[J]. Journal of Lipid Research, 1987,28:589-595.

[20] EBERINI I, ROCCO A G, IENTILE A R, et al. Conformational and dynamics changes induced by bile acids binding to chicken liver bile acid binding protein[J]. Proteins, 2008, 71(4):1889-1898.

[21] KANDA T, NIOT I, FOUCAUD L, et al. Effect of bile on the intestinal bile-acid binding protein (I-BABP) expression.in vitroandin vivostudies[J]. FEBS Lett, 1996, 384(2):131-134.

[22] GILARDI F, MITRO N, GODIO C, et al. The pharmacological exploitation of cholesterol 7α-hydroxylase, the key enzyme in bile acid synthesis:from binding resins to chromatin remodeling to reduce plasma cholesterol[J]. Pharmacology and Therapeutics, 2007, 116:449-472.

Extraction, Purification and Bile Acid-binding Capacityin vitroof Polysaccharides from Okra

REN Dan-dan，CHEN Gu*
(College of Light Industry and Food Sciences, South China University of Technology, Guangzhou 510640, China)

Q53

A

1002-6630(2010)13-0110-04

2009-09-18

任丹丹(1987—)，女，硕士研究生，研究方向为糖类物质及其药物的制备与生物利用。E-mail：rendandan619@163.com

*通信作者：陈谷(1973—)，女，副教授，博士，研究方向为糖类物质及其药物的制备与生物利用。E-mail：chengu@scut.edu.cn