PCR方法快速检测食品中幽门螺杆菌

史艳宇，刘金华，安 伟，李媛媛，王 莹，朱 颖，王 伟，刘俊会

(1.吉林省产品质量监督检验院，吉林 长春 130022；2.吉林出入境检验检疫局，吉林 长春 130062)

PCR方法快速检测食品中幽门螺杆菌

史艳宇1，刘金华2，安 伟1，李媛媛1，王 莹1，朱 颖1，王 伟1，刘俊会1

(1.吉林省产品质量监督检验院，吉林 长春 130022；2.吉林出入境检验检疫局，吉林 长春 130062)

目的：建立一种快速、特异、灵敏的幽门螺杆菌检测方法。方法：以尿素酶基因序列为靶位点设计引物，进行PCR扩增，建立幽门螺杆菌PCR检测方法。以食品中常见致病菌作参考菌株作特异性检测，分别对幽门螺杆菌菌悬液及鲜牛奶中幽门螺杆菌菌悬液进行梯度稀释，提取DNA后做灵敏度检测。结果：PCR方法能够有效对幽门螺杆菌进行快速检测，具有较强的特异性，灵敏度较高(8CFU/mL)。结论：该方法特异性强，灵敏度高，可以快速、准确检测食品中污染的幽门螺杆菌。

幽门螺杆菌；尿素酶基因；P CR；检测

Abstract：The contamination ofHelicobacter pyloriis considered as a serious problem to impair public health in both developed and developing countries. In order to establish a fast, specific and sensitive method to detect the contamination ofHelicobacter pyloriin food, PCR method was used to detect the DNA ofHelicobacter pyloribased on urease gene. Results indicated that this method was highly specific toHelicobacter pyloriand sensitive and presented a limit detection of 8 CFU/mL forHelicobacter pylori. Therefore, this method is applicable to clinical practice, environment control and inspection of exported food.

Key words：Helicobacter pylori；urease gene；PCR；detection

幽门螺杆菌(Helicobacter pylori，Hp)是一种弯曲、螺旋状革兰氏阴性杆菌。经流行病学调查证实，罹患胃病的人群中，有超过50%的人感染幽门螺杆菌，幽门螺杆菌感染与慢性萎缩性胃炎、十二指肠溃疡、胃黏膜相关性淋巴组织淋巴瘤和胃腺癌的发生有关[1-2]，WHO已经将幽门螺杆菌列为第一类致癌因子[3]。由于幽门螺杆菌与人类常见病密切相关且在人群中感染率高，因而受到重视。

幽门螺杆菌对体外生长条件要求苛刻，培养困难，传统培养方式对于快速准确进行检测与鉴定有一定难度[4]。因此如何快速检验这些食品中的幽门螺杆菌，保证人民食品安全，是一个重要课题。除了传统培养方法，现在国内外幽门螺杆菌其他检测方法主要有：直接镜检法、染色法、尿素酶法、免疫学法、核酸杂交技术、聚合酶链反应(PCR)、基因蕊片、毛细管电泳技术等[5]。这些方法在临床样品检测方面应用较多，但在食品中幽门螺杆菌检测方面应用较少，目前国内尚无食品中幽门螺杆菌快速有效检测方法及相关标准。

近年来大量研究证明，食品在人类感染幽门螺杆菌中起到重要作用，是幽门螺杆菌传播的途径之一[6-7]。因此研究食品中幽门螺杆菌的快速、简便、准确的检测鉴定方法尤其必要。

1 材料与方法

1.1 材料与菌株

鲜牛奶和鸡肉 市售。

幽门螺杆菌(Helicobacter pylori，ATCC 43504)；大肠杆菌(Escherichia coli，ATCC 25922)；金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus，ATCC 13565)；单增李斯特氏菌(Listeria monocytogenes，ATCC 15313)；沙门氏菌(Salmonella typhimurium，AS1.1194)；空肠弯曲菌(Campylobacter jejuni，ATCC 33291)。

1.2 试剂与培养基

细菌基因组小量提取试剂盒(AxyPrepTMMultisource Genomic DNA Miniprep Kit) 美国Axygen公司；TaqHS DNA聚合酶、dNTP(各2.5mmol/L)、10×buffer缓冲液、6 ×Loading buffer、100bp DNA Ladder Marker等宝生物工程(大连)有限公司；PCR引物由宝生物工程(大连)有限公司合成。

脑心浸液肉汤培养基(BHIB，根据产品说明书配制)青岛高科园海博生物技术有限公司；胰蛋白大豆琼脂 美国Becton Dickinson公司；ICPBIO无菌小牛血清 新西兰ICPBIO生物技术(集团)有限公司；无菌脱纤维马血烟台开发区品格林实验室配套设备有限公司。

1.3 仪器与设备

Microfuge 22R Centrifuge高速冷冻离心机 美国Beckman公司；M20食物研磨器 德国IKA公司；Tgradient-96 PCR扩增仪 德国Biometra公司；Bio Specmini DNA/RNA/蛋白分析仪 日本岛津公司；SAVANT PS500A电泳仪 美国Savant公司；EDAS290凝胶成像系统 美国Kodak公司；生化恒温培养箱 德国宾得公司；微量移液器(0.1～1000μL) 法国Gilson公司；M308277恒温水浴锅 北京中西远大科技有限公司；厌氧罐 日本三洋公司。

1.4 方法

1.4.1 幽门螺杆菌的稀释与计数

取幽门螺杆菌冻干粉接种于BHIB增菌肉汤培养基，按照5%培养基体积量加入无菌小牛血清，于微需氧条件下37℃振荡培养3d，在600nm波长处测定培养液吸光度。在吸光度达到1.0时，取1mL菌液涂胰蛋白大豆琼脂平板进行计数(单位CFU/mL)，另取1mL菌液用作模板DNA的提取。

1.4.2 DNA的提取

取幽门螺杆菌培养物，按细菌基因组小量提取试剂盒说明书的方法进行DNA提取，但相关步骤要略作修改：延长裂解酶作用时间至20min。用DNA分析仪检测其纯度及浓度。

1.4.3 幽门螺杆菌引物设计

根据幽门螺杆菌尿素酶基因，在Genebank中检索到1个基因序列(Accession M60398)。根据基因序列设计引物。在Genebank(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST)中，经Blast软件对相似序列搜索后，筛选出一套最优与常见致病菌无交叉反应的引物。

Forword primer：5＇-AAGCTTTTAGGGGTG TTAGGGGTTT-3＇；

Reverse primer：5＇-CAAGCCATCGCCGG TTTTAGC-3＇，扩增片段249bp。

1.4.4 反应体系和反应条件

反应体系(共20μL)：10×Ex TaqBuffer(Mg2+plus)2μL，dNTPs Mixture (各2.5mmol/L) 2μL，上下游引物(20μmol/L)各1μL，Ex Taq(5U/μL) 1μL，模板DNA 2μL，ddH2O 11μL。

反应条件：阶段1：95℃预变性2min；阶段2：94℃变性1min，61℃退火20s，72℃延伸30s，35个循环；阶段3：72℃延伸5min。

1.4.5 特异性实验

分别用大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、单增李斯特氏菌、沙门氏菌、空肠弯曲菌等食品中常见致病菌进行特异性实验。

1.4.6 灵敏度实验

取1mL在1.4.1节计数过的幽门螺杆菌菌悬液，梯度稀释后，分别提取DNA进行PCR检测，确定检测方法的灵敏度。

1.4.7 PCR方法用于实际食品样品检测

取鲜牛奶、鸡肉(制成匀浆)样品9mL与3mL幽门螺杆菌菌悬液充分混匀、离心，取沉淀提取DNA，进行PCR检测。

1.4.8 PCR方法测定牛奶中幽门螺杆菌的灵敏度

取1mL计数过的幽门螺杆菌菌悬液与9mL牛奶样品混合均匀，用牛奶分别进行10倍梯度稀释。分别提取DNA，按上述反应条件进行PCR扩增，检测食品基质对检测方法灵敏度的影响。

2 结果与分析

2.1 尿素酶基因特异性验证

在优化好的PCR反应体系和反应条件下，以大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、单增李斯特氏菌、沙门氏菌、空肠弯曲菌的DNA为特异性实验对照进行PCR检测。电泳结果显示，仅有幽门螺杆菌被扩增出条带，而其他对照以及阴性对照均未扩增出条带，具体结果见图1。

图1 幽门螺杆菌PCR特异性检测结果Fig.1 Specificity of PCR detection ofHelicobacter pylor

2.2 灵敏度实验

分别取各浓度幽门螺杆菌菌悬液，提取DNA进行PCR检测，结果显示利用尿素基因设计的引物对幽门螺杆菌的检测敏感性可达到8CFU/mL，具体结果见图2。

图2 PCR敏感性检测结果Fig.2 Sensitivity of PCR detection ofHelicobacter pylor

2.3 应用尿素酶基因检测人工污染样品中的幽门螺杆菌

应用尿素酶基因的特异引物对人工污染的鲜牛奶及鸡肉进行PCR检测，结果表明该方法能有效检测出试样中的幽门螺杆菌，具体结果见图3。

图3 检测人工污染样品中的幽门螺杆菌Fig.3 PCR detection ofHelicobacter pyloriin artificially contaminated samples

2.4 PCR方法测定鲜牛奶中幽门螺杆菌的灵敏度

取1mL计数过的幽门螺杆菌菌悬液与牛奶混合，梯度稀释后分别提取DNA进行PCR检测，结果显示牛奶中幽门螺杆菌的检测敏感度达到8CFU/mL，具体结果见图4。

图4 牛奶基质对PCR灵敏度检测结果的影响Fig.4 Sensitivity of PCR detection forHelicobacter pylori-contained milk

3 结 论

本研究根据尿素酶基因设计特异性引物，成功建立食品中幽门螺杆菌的PCR检测方法，填补了食品中幽门螺杆菌检测方法及标准的空白。与以往相关研究方法比较，本研究方法具有快速、灵敏(灵敏度为8CFU/mL)、特异的特点。

[2] GUILLERMO I P, ROTHENBACHER D, BRENNER H. Epidemiology ofHelicobacter pyloriinfection[J]. Helicobacter, 2004, 9(2):1-6.

[3] BROWN L M.Helicobacter pylori:Epidemiology and routes of transmission[J]. Epidemiologic Reviews, 2000, 22(2):283-297.

[4] STEVENSON T H, LUCIA L M, ACUFF G R, et al. Grow ofHelicobacter pyloriin various liquid and plating media[J]. Letters in Applied Microbiology, 2000, 30(3):192-196.

[5] 李会强. 幽门螺旋杆菌实验室诊断方法[J]. 中国慢性病预防与控制,2007, 15(2):187-190.

[6] GOMES B C, de MARTINIS E C P. The significant ofHelicobacter pyloriin water, food and environmental samples[J]. Food Control,2004, 15(3):397-403.

[7] FAN Xuegong, CHUA A, LI Tiegang, et al. Survival ofHelicobacter pyloriin milk and tap water[J]. Journal of Gastroenterology and Hepatology, 1998, 13(11):1096-1098.

Rapid PCR Detection ofHelicobacter pyloriin Food

SHI Yan-yu1，LIU Jin-hua2，AN Wei1，LI Yuan-yuan1，WANG Ying1，ZHU Ying1，WANG Wei1，LIU Jun-hui1
(1. Jilin Product Quality Supervision Inspection, Changchun 130022, China；2. Jilin Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau, Changchun 130062, China)

Q939.1

A

1002-6630(2010)18-0255-03

2009-12-15

国家质量监督检验检疫总局项目(2008QK059)

史艳宇(1977—)，女，高级工程师，博士，研究方向为食品生物技术。E-mail：shiyanyu219@163.com