不同沉淀方法分离甘薯β-淀粉酶的研究

贾彦杰，梁新红，朱文学，孙俊良,*，郭祖锋

(1.河南科技大学食品与生物工程学院，河南 洛阳 471003；2.河南科技学院食品学院，河南 新乡 453003)

不同沉淀方法分离甘薯β-淀粉酶的研究

贾彦杰1，梁新红2，朱文学1，孙俊良2,*，郭祖锋2

(1.河南科技大学食品与生物工程学院，河南 洛阳 471003；2.河南科技学院食品学院，河南 新乡 453003)

研究盐析法、有机溶剂沉淀法分离甘薯β-淀粉酶的工艺条件，分析盐析饱和度、有机溶剂体积比和溶液pH值对回收率及提纯倍数的影响。结果表明：硫酸铵饱和度在70%时，酶活性回收率达到78.1%，提纯1.56倍；乙醇体积比4:1时，酶活性回收率达到76.8%，提纯2.61倍；当溶液pH4.5～5.0、丙酮体积比3:1时，酶活性回收率可达到90.66%，提纯了3.29倍，此条件下β-淀粉酶分离效果最佳。

甘薯；β-淀粉酶；沉淀；分离；盐析

Abstract：Salting out and organic solvent precipitation methods were solely used to precipitateβ-amylase from the supernatant of sweet potato homogenate. The effects of saturation degree for salting out, volume ratio for organic solvents and pH on the recovery rate and purity ofβ-amylase were investigated. Results indicated that the specific activity ofβ-amylase reached up to 78.1% and its purity exhibited a 1.56-fold enhancement when the saturation degree of ammonium sulfate was 70%; the specific activity ofβ-amylase reached up to 76.8% and its purity exhibited a 2.61-fold enhancement when 4-fold volume of ethanol was added to the supernatant of sweet potato homogenate; and the highest separation efficiency was achieved and the specific activity ofβ-amylase reached up to 90.66% with a 3.29-fold enhancement in purity when pH varied from 4.5 to 5.0 and 3-fold volume of acetone was used instead of 4-fold volume of ethanol.

Key words：sweet potato；β-amylase；precipitation；separation；salting out

β-淀粉酶是一种水解酶，作用于淀粉时，分解淀粉分子中的α-1,4葡萄糖苷键，从还原性末端开始，按照麦芽糖单位依次水解，同时发生沃尔登转化，使产物由α型变为β型麦芽糖，因此称为β-淀粉酶[1-2]。β-淀粉酶在食品加工、酿造、粮食加工以及医药等行业具有重要应用价值[3]。β-淀粉酶存在于植物与微生物中，而我国目前利用微生物发酵生产的β-淀粉酶主要有耐热性差，成本较高等缺点。而从植物中提取的β-淀粉酶具有酶活力高、耐热性较好、作用pH值范围广等特点。植物β-淀粉酶主要存在于甘薯、麦麸、大豆、大麦芽以及萝卜中。我国甘薯、麦麸产量很高，价格低廉，可以从中提取β-淀粉酶[4]。甘薯β-淀粉酶酶活力高、淀粉易回收，因此甘薯是制备β-淀粉酶最为理想的原料[5]。

盐析沉淀法是许多酶初纯阶段经常采用的方法，而有机溶剂沉淀无需专门方法去除沉淀剂，此法简便、安全[6]。目前，关于乙醇沉淀分离β-淀粉酶的研究已有报道[7]，而有关盐析及其他有机溶剂沉淀分离β-淀粉酶相比较的工艺研究尚未见报道。本实验通过硫酸铵盐析、乙醇及丙酮沉淀方法分离甘薯β-淀粉酶，以期找到较为合适的分离方法，为工业化生产提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

甘薯 市售；考马斯亮蓝G-250、牛血清白蛋白、3,5-二硝基水杨酸等(均为分析纯)。

1.2 仪器与设备

RC5C型冷冻离心机 美国Sovall公司；pHSJ-3F型实验室pH计、FA1204B型分析天平 上海精密科学仪器有限公司；7200型分光光度计 尤尼克(上海)仪器有限公司；SQ2002多功能食品加工机 上海帅佳电子科技有限公司；MD34透析袋(8000～14000kD) 美国联合碳化物公司。

1.3 方法

1.3.1 粗酶液提取

取新鲜甘薯50g，洗净后切成1cm3左右小块，加入100mL的去离子水，于匀浆机中匀浆(26000r/min，1min)，4层纱布过滤，滤液冷冻离心(4℃，4000r/min，15min)，取上清液4℃冰箱中保藏备用。

1.3.2 硫酸铵盐析甘薯β-淀粉酶方法

取7支试管，每支加入粗酶液5mL，分别加入硫酸铵至饱和度为20%、40%、60%、70%、80%、90%、100%，边加边搅拌，混匀后，用磷酸-柠檬酸缓冲液调节溶液pH值至5.0，4℃冰箱中放置4h，8000r/min冷冻离心15min后，收集沉淀。将沉淀用磷酸缓冲液溶解，选用截留分子量为1万D的透析袋透析除盐24h。测透析后甘薯β-淀粉酶酶活力及蛋白含量，计算出回收率及提纯倍数。

1.3.3 乙醇、丙酮分级沉淀甘薯β-淀粉酶方法

取一定量粗酶提取液，缓慢加入预冷乙醇或丙酮分别至不同体积比(乙醇:粗酶液，V/V，下同)，用磷酸-柠檬酸缓冲液调节溶液pH值至5.0，4℃冰箱中放置4h，8000r/min冷冻离心15min后，收集沉淀，将沉淀用磷酸缓冲液溶解。测沉淀分离后甘薯β-淀粉酶酶活力及蛋白含量，计算出回收率及提纯倍数。

1.3.4 甘薯β-淀粉酶酶活回收率计算

1.3.5 甘薯β-淀粉酶提纯倍数计算

蛋白质测定采用考马斯亮蓝G-250法[9]。

2 结果与分析

2.1 不同饱和度硫酸铵对甘薯β-淀粉酶分离效果影响

植物β-淀粉酶提取过程中有许多成分的物质溶出，除杂与提纯是确定酶活性稳定的要素[10]。选用不同饱和度硫酸铵盐析甘薯粗提取液，根据1.3.2节所述方法，考察不同饱和度硫酸铵对甘薯β-淀粉酶回收率及提纯倍数影响，结果见图1、2。

图1 不同饱和度硫酸铵对β-淀粉酶回收率的影响Fig. 1 Effect of (NH4)2SO4with various saturation degrees on the recovery rate ofβ-amylase from the supernatant of sweet potato homogenate

图2 不同饱和度硫酸铵对β-淀粉酶提纯倍数影响Fig.2 Effect of (NH4)2SO4with various saturation degrees on the purification fold ofβ-amylase from the supernatant of sweet potato homogenate

图1表明，不同饱和度硫酸铵对β-淀粉酶回收率影响较大。硫酸铵饱和度在20%～40%范围内，回收率变化不大。随着硫酸铵饱和度增加，酶活回收率呈增大趋势，在70%时β-淀粉酶活性回收率最高达到(78.05±0.8)%，饱和度在大于80%时，酶活回收率迅速降低。分析图2可知，硫酸铵饱和度在70%时，提纯倍数达到最大，提纯(1.56±0.031)倍。经显著性方差分析，硫酸铵饱和度在60%～80%范围内，P＜0.05水平上回收率及提纯倍数都有显著性差异，因此，硫酸铵盐析β-淀粉酶最佳饱和度为70%。

2.2 有机溶剂沉淀β-淀粉酶实验

2.2.1 乙醇不同添加量对甘薯β-淀粉酶回收率及提纯倍数的影响

图3 不同体积比乙醇对甘薯β-淀粉酶回收率的影响Fig.3 Effect of ethanol amount on the recovery rate ofβ-amylase from the supernatant of sweet potato homogenate

由图3可知，在乙醇体积比为0.2:1～4:1条件下，酶活性回收率随着乙醇体积比的增加而增大，在4:1处达到最大为(76.80±0.03)%。这与文献报道的乙醇体积比不同，可能是因为甘薯不同品种所致[11]。经显著性方差分析，乙醇体积比在3:1～4:1范围内，在P＜0.05水平上没有显著性差异。图4结果表明，在体积比0.2:1～5:1范围内，提纯了(0.21±0.014)～(2.62±0.16)倍，在体积比4:1时，提纯倍数达到最大，达到2.62倍。经显著性方差分析，在体积比3:1～5:1范围内，在P＜0.05水平上有显著性差异。因此，乙醇沉淀β-淀粉酶最佳体积比为4:1。

图4 不同体积比乙醇对甘薯β-淀粉酶提纯倍数的影响Fig.4 Effect of ethanol amount on the purification fold ofβ-amylase from the supernatant of sweet potato homogenate

2.2.2 不同丙酮添加量对甘薯β-淀粉酶回收率及提纯倍数的影响

图5 不同体积比丙酮对甘薯β-淀粉酶回收率的影响Fig.5 Effect of acetone amount on the recovery rate ofβ-amylase from the supernatant of sweet potato homogenate

图6 不同体积比丙酮对甘薯β-淀粉酶提纯倍数的影响Fig.6 Effect of acetone amount on the purification fold ofβ-amylase from the supernatant of sweet potato homogenate

由图5可知，不同的丙酮与粗酶液体积比对β-淀粉酶回收率影响较大。体积比为0.2:1～3:1范围时，酶活回收率逐渐升高，在3:1处达到最大，回收率为(88.05±0.05)%，然后随着丙酮用量的增加，回收率逐渐降低。图6分析可知，丙酮与粗酶液体积比为3:1时，提纯倍数最高，提纯(2.64±0.09)倍。经显著性方差分析，在丙酮体积比2:1～4:1范围内，P＜0.05水平上回收率及提纯倍数都有显著性差异。因此，丙酮沉淀β-淀粉酶最佳体积比为3:1。

由以上硫酸铵、乙醇、丙酮沉淀甘薯β-淀粉酶对比实验可知，丙酮沉淀效果最佳，在丙酮与粗酶液体积比3:1时，回收率及提纯倍数达到最高，分别为(88.05±0.05)%、2.64±0.09。

2.2.3 丙酮沉淀β-淀粉酶最佳pH值的确定

由于酶蛋白在其等电点处静电荷为零，溶解度最低，容易沉淀析出，故在确定丙酮沉淀甘薯β-淀粉酶体积比3:1为最佳分离条件后，按上述工艺加入丙酮，用磷酸缓冲液分别调节溶液pH值至4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0，测定甘薯β-淀粉酶酶活及蛋白含量。计算酶活回收率及提纯倍数，结果如图7、8所示。

图7 不同pH值对甘薯β-淀粉酶回收率的影响Fig.7 Effect of pH of acetone solution on the recovery rate ofβamylase from the supernatant of sweet potato homogenate

图8 不同pH值对甘薯β-淀粉酶提纯倍数的影响Fig.8 Effect of pH of acetone solution on the purification fold ofβamylase from the supernatant of sweet potato homogenate

由图7分析可知，沉淀β-淀粉酶时pH值对酶回收率影响较明显。在pH4.0～4.5范围内，酶活性回收率迅速增大，在pH4.5时达到最大值(90.66±0.02)%，随着pH值继续增大，回收率又逐渐降低。图8表明，pH值对β-淀粉酶提纯倍数影响较大，变化范围为(2.27±0.12)～(3.29±0.17)，在pH5.0处达到最大，提纯(3.29±0.17)倍。经显著性方差分析，在pH4.5～5.5范围内，P＜0.05水平上酶活回收率没有显著性差异，在pH4.0～6.0范围内提纯倍数有显著性差异。综合分析，pH5.0为丙酮沉淀β-淀粉酶最佳pH值。

3 结论与讨论

3.1 通过对硫酸铵盐析和有机溶剂沉淀甘薯β-淀粉酶进行比较实验，得出利用丙酮沉淀分离β-淀粉酶为最佳的分离条件，当丙酮体积比3:1、pH4.5～5.0时回收率最高可达90.66%，提纯3.29倍，这与李莹等[7]的乙醇沉淀甘薯β-淀粉酶结果相比较，提纯倍数有较大的提高，由此可知，用丙酮沉淀甘薯β-淀粉酶更为合理。

3.2 随着pH值的变化，酶活性回收率及提纯倍数变化幅度较大，说明在强酸强碱条件下，酶液易失活[12-13]。在pH4.5处，酶液表现出较高活性。

3.3 通过最佳pH的实验结果可知，在pH5.0处提纯倍数达到最高，由于在等电点处蛋白质易沉淀，可知甘薯β-淀粉酶的等电点应为5.0左右。这与朱婉华等[14]测得的大豆β-淀粉酶等电点基本一致。

3.4 本实验通过对β-淀粉酶分离方法的比较实验，得出了较为合适的分离方法，为β-淀粉酶的进一步纯化提供了重要依据。

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Separation ofβ-amylase from Sweet Potato by Different Precipitation Methods

JIA Yan-jie1，LIANG Xin-hong2，ZHU Wen-xue1，SUN Jun-liang2,*，GUO Zu-feng2
(1. College of Food and Bioengineering, Henan University of Science and Technology, Luoyang 471003, China；2. College of Food, Henan Institute of Science and Technology, Xinxiang 453003, China)

Q814.1

A

1002-6630(2010)18-0022-04

2010-05-20

河南省科技计划项目(102102210192)；河南科技学院博士基金项目(09001)

贾彦杰(1985—)，男，硕士研究生，主要从事食品生物技术研究。E-mail：henankeyuan@126.com

*通信作者：孙俊良(1964—)，男，教授，博士，主要从事食品发酵微生物与酶制剂研究。E-mail：sjl@hist.edu.cn