重组水稻α-半乳糖苷酶的分离纯化及酶学性质研究

李苏红，朱旻鹏，李拖平*

(1.沈阳师范大学工程技术学院，辽宁 沈阳 110034；2.辽宁大学轻型产业学院，辽宁 沈阳 110036)

重组水稻α-半乳糖苷酶的分离纯化及酶学性质研究

李苏红1，朱旻鹏1，李拖平2,*

(1.沈阳师范大学工程技术学院，辽宁 沈阳 110034；2.辽宁大学轻型产业学院，辽宁 沈阳 110036)

对重组水稻α-半乳糖苷酶的分离纯化及其酶学性质进行研究。结果表明：该重组酶分子质量约为59kD；最适酶反应温度为45℃，最适pH值为5.0；酶活力在0～20℃，pH4.0～7.0最为稳定；酶学动力学常数Km为0.78mmol/L，Vmax为10.16mmol/(mg·min)。多数的金属离子和有机离子对酶催化作用没有影响，Hg2+、Ag+及－SH基团抑制剂p-chloromercuribenzoic acid(pCMB)对酶活性有强烈抑制作用。

重组；α-半乳糖苷酶；纯化；酶学性质

Abstract：A crude enzyme solution rich in recombinant riceα-galactosidase from the engineering strainE. colipET-32a (+)-Gal/ Origami DE obtained from our laboratory was prepared and purified on a Ni-Sepharose affinity column. The purifiedαgalactosidase showed a single protein band in SDS-PAGE with a molecular mass of 59 kD. This enzyme exhibited the highest activity at the conditions of pH 5.0 and 45 ℃. Meanwhile, it showed the best stability at pH 4.0－7.0 and 0－20 ℃. The kinetic parametersKm andVmax were 0.78 mmol/L and 10.16 mmol/(mg·min), respectively. Most of metal and organic ions did not affect the activity of this enzyme. However, Ag+, Hg2+andpCMB (p-chloromercuribenzoic acid) significantly decreased its activity by 84%, 87% and 92%, respectively.

Key words：recombinant；α-galactosidase；purification；enzymatic characterization

很多的植物低聚糖和多糖中都发现有半乳糖苷，它主要出现在植物贮存营养物质和进行光合作用活跃的组织里[1]，α-半乳糖苷酶(α-galactosidase，α-Gal，EC3.2.1.22)属外切糖苷酶类，能够专一性催化非还原末端α-半乳糖苷键的水解，它不仅能够水解含α-半乳糖苷的半乳甘露低聚糖和棉子糖族低聚糖(如蜜二糖、棉子糖、水苏糖、毛蕊花糖等)；而且能够水解含该键的多糖，如α-半乳甘露聚糖等。此外，它还能作用于含有α-半乳糖苷的糖蛋白和糖脂质[2-5]。α-半乳糖苷酶广泛存在于植物、动物和微生物中，α-半乳糖苷酶在食品、制糖、饲料、医药工业等领域得到广泛的应用[6]。

不同来源的α-半乳糖苷酶其理化特性相差明显。根据其氨基酸序列的同源性在CAZy数据库(http://afmb.cnrs-mrs.fr/CAZy/)中α-半乳糖苷酶被分类于糖水解酶家族(GH family)的第4、27、36和57族。其中来源于真核生物的酶具有相当程度的同源性，多属于第27族。而来源于细菌类的酶则多属于第36族。

以植物取材的α-半乳糖苷酶研究的较多[1-3]。在各种动物组织中，以人和鼠的甲状腺、肾和脾的酶活最高[7]。在20世纪60～70年代，国内外开始微生物产α-半乳糖苷酶及酶性质的研究，已筛选出一些产α-半乳糖苷酶活性的微生物，主要有短双歧杆菌、青霉菌、酵母菌、放线菌等。1972年，Beutlert等[8]首次研究了α-半乳糖苷酶动力学和热力学稳定性，使人们对α-半乳糖苷酶的特性有了更深一步了解。随着分离纯化技术的发展，研究得到了越来越多的纯化酶。近年来，基因工程技术的应用为高活力α-半乳糖苷酶的提取制备提供了一个广阔的空间。一些不同来源的α-半乳糖苷酶基因被克隆并在大肠杆菌、毕赤酵母中获得表达。我国α-半乳糖苷酶的商品化生产量少、种类贫乏且价格昂贵，通过基因工程获得高活力、热稳定及pH值稳定范围广的α-半乳糖苷酶是该酶大规模生产应用的有效途径。

目前，水稻的全基因组序列已经确定[9]。核酸序列数据库中有7个被推定为α-半乳糖苷酶基因，本实验报道了源于水稻α-半乳糖苷酶基因之一(BAC79549)重组酶(recombinant riceα-Gal)的纯化及酶学性质。以期为拓宽α-半乳糖苷酶在食品、饲料添加剂等方面的应用和对水稻全基因组的构造及其生理生化机能的解析提供参考。

1 材料与方法

1.1 菌种

基因重组水稻α-半乳糖苷酶(BAC79549)的大肠杆菌工程菌株(pET-32a(+)-Gal/OrigamiDE)[10]由本实验室提供。

1.2 试剂与仪器

pNPG 蜜二糖、棉子糖、水苏糖、槐豆胶和角豆胶 美国Sigma公司；牛血清白蛋白和蛋白质分子质量标准 Takara公司；HisTrap HP(镍离子螯合柱)和PD-10脱盐柱 Aamershampharmacia Biotech公司；其余试剂为国产分析纯。

AKTAFPLC蛋白纯化系统和蛋白电泳仪Aamershampharmacia Biotech公司。

1.3 重组水稻α-半乳糖苷酶的制备

将大肠杆菌工程菌株按1%接于含卡那霉素(15μg/mL)、四环素(12.5μg/mL)和氨苄青霉素(50μg/mL)的LB培养基中在15℃、250r/min条件下培养，同时加入异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)(0.1mmol/L)诱导72h。4℃、6000r/min离心10min，弃上清液收集菌体。用pH7.0，含有500mmol/L NaCl的50mmol/L HEPES缓冲液悬浮菌体，在冰水浴中超声破碎菌体后，4℃、10000r/min离心10min收集上清，即得粗酶液。

1.4 重组水稻α-半乳糖苷酶的纯化

将5mL过滤后的粗酶液加入用平衡缓冲液(pH7.0，含500mmol/L NaCl的50mmol/L HEPES)平衡好的1mL HisTrap HP，以1mL/min的流速用上述平衡缓冲液洗柱8min后，用咪唑(imidazole)浓度0至500mmol/L的平衡缓冲液对目的蛋白进行线性梯度洗脱。用SDS-PAGE电泳鉴定纯化蛋白，最后用PD-10脱盐柱脱盐。

1.5 蛋白质分子质量和浓度的测定

采用LaemmLi法进行SDS-PAGE测定蛋白质分子质量。采用Lowry法，以牛血清白蛋白为标准测定蛋白质浓度。

1.6 酶活力测定

将0.1mL的10mmol/LpNPG与0.8mL的McIlvaine缓冲液(pH5.0)混合，于45℃预热5min后，加入0.1mL的酶液混匀，45℃条件下准确反应10min，立即加入1mL的0.2mol/L Na2CO3溶液终止反应。在405nm波长处测其OD值，以对硝基酚的生成量表示酶活力。一个酶活力单位(U)定义为每分钟分解pNPG释放1μmol对硝基酚所需的酶量。

1.7 重组水稻α-半乳糖苷酶酶学性质研究

1.7.1 酶的最适反应pH值及pH值稳定性

在pH值分别为3.0～9.5之间的反应体系中测定酶活力，研究酶促反应的最适pH值。将酶分别置于不同pH值的缓冲体系中，20℃保温1h，测定其对应的剩余相对酶活力，以酶活力最高者为100%，研究酶的pH值稳定性。pH3.0～7.5用McIlvaine缓冲液；pH7.0～8.5用0.1mol/L HEPES缓冲液；pH8.5～9.5用Glycine-NaOH缓冲液。

1.7.2 酶的最适反应温度及热稳定性

分别在20～60℃范围内测定酶活力，考察酶的最适反应温度。将酶液置于pH5.0的缓冲体系中，分别在不同温度下保持1h，测定其对应的剩余相对酶活力，以酶活力最高者为100%，考察酶的温度稳定性。

1.7.3 不同金属离子对酶活力的影响

在反应体系中分别加入各种金属离子及化合物，使其在反应体系中的终浓度达到1mmol/L，然后测定酶活力，以未加入的酶液做对照，考察金属离子及化合物对酶活力的影响。

1.7.4 动力学常数Km测定

将酶液分别与0.5、1、2、3、5、10mmol/L的pNPG作用，每隔1min取样，在405nm波长处测其OD值测定，用Line-weaver-Burk 双倒数作图法求出以pNPG为底物的酶的Km值。

2 结果与分析

2.1 重组水稻α-半乳糖苷酶的镍离子螯合柱亲和纯化

图1 重组水稻α-半乳糖苷酶的镍离子螯合柱亲和纯化Fig.1 Purification of recombinant riceα-galactosidase on Ni-Sepharose affinity column

经多次实验比较，确定重组水稻α-半乳糖苷酶粗酶液在pH值为7的条件下，经HisTrap HP (镍离子螯合柱)进行纯化的效果最好，纯化结果如图1。

纯化的酶经12.5%的SDS-PAGE电泳检测，如图2所示，纯化后仅有一条单一的蛋白条带，分子质量约为59kD，其上带有Trx·Tag约17kD，因而估算天然水稻α-半乳糖苷酶的分子质量约为42kD，与CAZy数据库的推算相吻合。

图2 重组水稻α-半乳糖苷酶的SDS-PAGE电泳Fig.2 SDS-PAGE of recombinant riceα-galactosidase

重组水稻α-半乳糖苷酶的纯化结果见表1，活力回收率为21.2%，纯化倍数为29.7，纯化酶的比活力为9.5U/mg。

表1 重组水稻α-半乳糖苷酶的纯化Table 1 Results of purification of recombinant riceα-galactosidase

酶的快速纯化一直都是酶工程研究中有待突破的难点。本实验采用的大肠杆菌工程菌株pET-32a(+)-Gal/Origami DE可利用载体上固有的融合蛋白Trx·Tag使酶基因稳定高效表达，在此基础上根据载体上特有的纯化标签，采用镍离子亲和层析技术对蛋白质进行了快速纯化，经一步纯化即得到纯度较高的酶蛋白。

2.2 重组水稻α-半乳糖苷酶的酶学性质

2.2.1 酶的最适反应pH值及pH值稳定性

纯化的重组水稻α-半乳糖苷酶在不同pH值缓冲液体系中，测定其酶活性结果如图3所示，酶的最适反应pH值为5.0，当pH值大于5.5或小于4.5时，酶的活性都会急剧下降。该酶在不同的pH值缓冲液体系中，20℃中保温1h，其pH稳定性如图4所示，在pH4.0～7.0之间，保持着90%以上的酶活性。

图3 pH值对重组水稻α-半乳糖苷酶活性的影响Fig.3 Effect of pH on the activity of recombinant riceα-galactosidase

图4 pH值对重组水稻α-半乳糖苷酶稳定性的影响Fig.4 Effect of pH on the stability of recombinant riceα-galactosidase

2.2.2 酶的最适反应温度及热稳定性

图5 温度对重组水稻α-半乳糖苷酶活性的影响Fig.5 Effect of temperature on the activity of recombinant riceα-galactosidase

在上述标准反应体系中，于20～60℃分别测定酶活力，结果如图5所示，该酶的最适反应温度为45℃。酶的热稳定性实验表明(图6)，该酶在0～20℃是稳定的，保温1h后剩余相对酶活力仍为100%。保存温度超过20℃，其热稳定性急剧下降，大于40℃时酶活力丧失为0，对高温颇为敏感。该酶在0～4℃，加入牛血清蛋白(2mg/mL)做保护剂的情况下，可保存数月酶活力不变。

2.2.3 不同金属离子及有机离子对酶活力的影响

由表2可知，大部分的金属离子及化合物对酶活力几乎没有影响，而Hg2+、Ag+及对酶活性有强烈抑制作用。Hg2+对α-半乳糖苷酶活性的抑制可以推测是由于酶分子结构中的半胱氨酸在酶的活性中心位置[11]；Ag+对α-半乳糖苷酶活性的抑制则说明酶的活性中心可能存在具有羧基的氨基酸或组氨酸[12]。一些α-半乳糖苷酶的活性会被－SH基团抑制剂如pCMB所抑制，同样pCMB对水稻α-半乳糖苷酶的酶活性也表现了强烈的抑制作用，这可能是因为该酶在活性中心或其附近存在巯基[13]。

表2 一些金属离子及有机离子对重组水稻α-半乳糖苷酶活力的影响Table 2 Effects of organic and metal ions on the activity of recombinant riceα-galactosidase

图6 温度对重组水稻α-半乳糖苷酶稳定性的影响Fig.6 Effect of temperature on the stability of recombinant riceαgalactosidase

2.2.4 酶动力学参数的确定

图7 pNPG浓度与反应速率的Lineweaver-Burk双倒数曲线Fig.7 Lineweaver-Burk plot of recombinant riceα-galactosidase

以pN P G作为底物，测定底物反应速率，用Lineweaver-Burk双倒数作图法(图7)求得Km值为0.78mmol/L；Vmax为 10.16mmol /(mg·min)。

3 结 论

根据实验得酶活力回收率为21.2%，纯化倍数为29.7，纯化酶的比活性为9.5U/mg。SDS-PAGE电泳检测重组酶分子质量约为59kD，推测天然水稻α-半乳糖苷酶的分子质量约为42kD。酶的最适反应pH值为5.0，在pH4.0～7.0之间稳定性高。酶的最适反应温度为45℃，分别在0～20℃保温1h后剩余酶活力仍为100%，可在0～4℃长期保存。酶的动力学常数Km为0.78mmol/L，Vmax为10.16mmol/(mg·min)。 Hg2+、Ag+及－SH抑制剂pCMB对酶活性有强烈抑制作用。

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Isolation, Purification and Characterization of Recombinantα-Galactosidase from Rice

LI Su-hong1，ZHU Min-peng1，LI Tuo-ping2,*
(1. College of Engineering and Technology, Shenyang Normal University, Shenyang 110034, China；2. College of Light Industry, Liaoning University, Shenyang 110036, China)

TS201.2

A

1002-6630(2010)21-0304-04

2010-06-28

辽宁省科技厅博士科研启动资助项目(20081031)；教育部归国留学人员科研启动基金项目

李苏红(1968—)，女，副教授，博士，研究方向为食品生物技术。E-mail：leesuhong@126.com

*通信作者：李拖平(1967—)，男，教授，博士，研究方向为应用糖质化学。E-mail：ltp0401@126.com