酶膜反应器制备的蛋清水解物的营养评价

杨万根，王卫东，孙月娥，王 璋，程云辉

(1.徐州工程学院食品工程学院，江苏 徐州 221008；2.江南大学食品学院，江苏 无锡 214122；3.长沙理工大学化学与生物工程学院，湖南 长沙 410114)

酶膜反应器制备的蛋清水解物的营养评价

杨万根1，王卫东1，孙月娥1，王 璋2，程云辉3

(1.徐州工程学院食品工程学院，江苏 徐州 221008；2.江南大学食品学院，江苏 无锡 214122；3.长沙理工大学化学与生物工程学院，湖南 长沙 410114)

对酶膜反应器(EMR)制备的蛋清水解物进行营养评价。用配备截留分子质量10kD超滤膜的EMR制备并经大孔吸附树脂层析得到精制的蛋清水解物。以天然蛋清为对照物，分析水解物的游离氨基酸组成、相对分子质量分布及其氨基酸组成，并根据氨基酸分析结果进行氨基酸评分。结果发现：水解物的游离氨基酸质量分数为0.386%；水解物中2～4个氨基酸残基组成的肽的质量分数约占71%；EMR蛋清水解物所含的必需氨基酸占氨基酸总量的44.8%，氨基酸评分值为113.3，比天然蛋清的氨基酸评分值提高105.6%。该水解物易被人体吸收、营养均衡而价值较高，可广泛应用于营养保健食品中。

酶膜反应器(EMR)；蛋清水解物；氨基酸评分；相对分子质量分布

Abstract：In this study, the egg white hydrolysates which were prepared using an enzymatic membrane reactor (EMR) equipped with a 10 kD molecular weight cut-off ultra-filtration membrane, and refined by macroporous adsorption resin chromatography were analyzed and evaluated for their nutritional composition. Native egg white was used as the control to analyze their free amino acid composition, relative molecular mass distribution and amino acid composition. Besides, their amino acid scores were determined according to the analytical results of amino acid composition. The results indicated that the free amino acid content of the hydrolysates was 0.386%. The peptides composed of 2 to 4 amino acid residues in the hydrolysates were approximately 71%. The essential amino acids in the hydrolysates represented approximately 44.8% of the total amino acids and their amino acid score was 113.3, which was much higher than that of native egg white (55.1). The hydrolysates were characteristic of fast absorption, balanced nutrition and high healthcare value. As a conclusion, they can be extensively applied in functional food products.

Key words：enzymatic membrane reactor (EMR)；egg white hydrolysate；amino acid score；relative molecular mass distribution

动、植物蛋白经过酶水解得到的水解物的分子质量降低，溶解性、热稳定性等功能性质改善，致敏性降低，易于被人体吸收，并且蛋白水解物还具有抗氧化、降血压和降血脂等生物活性，使得蛋白水解物在各种营养保健食品中有着广泛的应用前景[1-3]。我国的鸡蛋产量排名世界第一位，早在2005年我国的鸡蛋产量已经占到了世界总产量的40%以上[4]。蛋清是一种蛋白质含量约为10.6%的水溶液。在国内，蛋黄被大量用做糕点、月饼生产的原料，而蛋清常常作为废弃物被丢弃，既污染了环境，又造成宝贵蛋白质资源的极大浪费。以蛋清蛋白为原料开发蛋白水解物，不仅成本低、附加值高，而且变废为宝，具有较高的经济价值和重要的环保意义。酶膜反应器(EMR)是将膜过滤和酶催化反应结合在一起的系统，可以连续制备小分子蛋白质水解物，具有节约用酶成本、产品品质均一等优点，已被应用于制备各种来源的蛋白质水解物[5-6]。本实验采用酶膜反应器制备蛋清水解物，对水解物进行营养评价，以期为该制备方法得到的蛋清水解物的应用提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

冻干蛋清粉(自制)：购自当地市场的新鲜鸡蛋，分离得蛋清，冷冻干燥，研磨成粉，在－18℃保存。

Protease N“Amano”蛋白酶 Amano酶制剂公司；乙腈(色谱纯) 国药集团化学试剂有限公司；DA201-C大孔吸附树脂 江苏苏青水处理工程集团；分子质量校正曲线所用标准品(细胞色素C，抑肽酶、杆菌酶、乙氨酸-乙氨酸-酪氨酸-精氨酸、乙氨酸-乙氨酸-乙氨酸) Sigma公司；其他化学试剂为化学纯。

1.2 仪器与设备

超滤系统(包括PelliconTM-2 Mini膜夹具、BiomaxTM10聚醚砜超滤膜膜包(截留面积0.1m2，截留分子质量10kD)、Millipore蠕动泵) 美国Millipore公司；501型超级恒温器 上海实验仪器厂有限公司；77585-306L落地式冻干机 美国Labconco公司；JB300-D型强力电动搅拌机 上海标本模型厂；Agilent 1100安捷伦液相色谱仪 美国安捷伦公司；夹套玻璃反应器 无锡湖景玻璃仪器商店。

1.3 方法

1.3.1 水解物的制备

配制2L 1g/100mL蛋清溶液、pH10的蛋清溶液，迅速升温至85℃并恒温30min，完成蛋清的预处理[7]；将处理好的1L蛋清溶液转入EMR反应器中，用强力搅拌机在500r/min速度下搅拌，使蛋清溶液在55℃恒定。其余蛋清溶液作补液，在60℃恒温水浴锅中保温。调节反应器中的蛋清溶液至pH8，加入1%(以蛋清蛋白计)的Protease N蛋白酶开始水解。在水解初始0.5h内，关闭超滤装置，使反应在反应器中进行。0.5h后开启超滤装置，滤过液流速为10mL/min，收集浓缩液。进样压力设定在0.13～0.15MPa；水解过程中添加蛋清补液使反应液体积不变，并滴加1mol/L的NaOH溶液使反应液pH值恒定；反应4 h后，终止反应。

1.3.2 水解物的精制

用DA201-C大孔吸附树脂吸附浓缩液，以去离子水洗脱树脂，再用85%酒精洗脱树脂得到水解物溶液，浓缩后冷冻干燥得到精制水解物。

1.3.3 氨基酸组成分析

精确称取精制水解物，溶于6mol/L盐酸中，110℃水解24h，蒸干盐酸，定容得水解液。采用高效液相分析仪测定水解液中的氨基酸组成，实验重复两次，结果取平均值。高效液相色谱条件：C18柱(4.0 mm×125mm)；柱温40℃；流速1.0mL/min；检测波长338nm和262nm(Pro)；流动相A：20mmol/L醋酸钠液，流动相B：20mmol/L醋酸钠液、甲醇、乙腈体积比为1:2:2。

1.3.4 游离氨基酸组成分析

精确称取1g样品，溶解在10mL 6g/100mL的三氯乙酸溶液中，在室温下静置1h，然后转移至50mL容量瓶中，定容。用滤纸过滤两次后，取1mL在1.0×104×g条件下离心10min。上清液经在线自动衍生化用Agilent 1100高效液相色谱分析仪测定水解液中氨基酸组成。实验重复两次，结果取平均值。

1.3.5 分子质量分布分析

0.1 g/mL样品溶液经0.45μm微孔滤膜过滤后上TSK gel 2000色谱柱，将样品的色谱数据代入校正曲线方程中进行计算，得到样品的肽分子质量及其分布范围。高效液相色谱仪条件：色谱柱TSK gel 2000(7.8mm×300mm)，柱温30℃，流速0.5mL/min，检测波长220nm，流动相：乙腈、水、三氟乙酸体积为45:55:0.01。

2 结果与分析

2.1 游离氨基酸组成

表1显示，水解物中游离氨基酸的质量分数为0.386%，其中亮氨酸、缬氨酸、丙氨酸等游离氨基酸的含量较高。Cheison等[8]在研究EMR酶法制备乳清蛋白水解物时，其水解物的游离氨基酸质量分数一样较低，仅为2.64%。EMR酶法制备得到的水解产物中游离氨基酸数量较少，一方面是因为Protease N蛋白酶是一种内切酶，水解产物主要为活性肽[9]；另一重要方面是因为小肽能及时地经超滤膜从酶反应体系中排出，防止了小肽被蛋白酶进一步水解成游离氨基酸。

2.2 分子质量分布

如表2所示，峰1、峰2、峰3组分的分子质量范围在953～5909D之间，质量分数占10.57%，说明产物主要是由含量接近90%、分子质量在1000D以下的肽组成。由于产物的平均氨基酸相对分子质量为132.75(由表3中产物的氨基酸组成计算而得)，因此峰4组分是由含4～8个氨基酸残基的肽组成，峰5组分是由含3～4个氨基酸残基的肽组成，峰6组分是由含2～3个氨基酸残基的肽组成，而峰7组分则主要由游离氨基酸组成。Cheison等[8]报道，EMR酶法制备的乳清蛋白水解物中，分子质量在1250D以下的肽的质量分数约80%，在本实验中，蛋清水解物中1000D以下的肽的质量分数达到了86%以上，产物中含2～4个氨基酸残基的肽的含量在71%左右，因此水解物主要是由小肽组成。有研究证明，小肽的吸收具有速度快、耗能低、载体不易饱和，且各肽之间运转无竞争性与抑制性等优点[10]。

表1 蛋清水解物的游离氨基酸组成Table 1 Free amino acid composition of the egg white hydrolysates

表2 EMR蛋清水解物的分子质量分布及质量分数Table 2 Molecular mass distribution of the egg white hydrolysates

2.3 氨基酸组成

以天然蛋清为对照物，EMR蛋清水解物的氨基酸组成的测定结果如表3所示，两者除了甘氨酸、半胱氨酸和蛋氨酸3种氨基酸的质量分数有较大差别外，其他氨基酸的质量分数相差不大。表4显示水解物及天然蛋清的必需氨基酸占全部氨基酸的质量分数分别是44.8%和44.6%，蛋清水解物的质量分数比天然蛋清稍高，但两者相差不大，说明水解后蛋清中必需氨基酸的数量增加，但增加的幅度不大。水解物的必需氨基酸的质量分数超过FAO/WHO 模式[11]中必需氨基酸的质量分数35%，说明它是一种优质的蛋白质来源。

表3 天然蛋清及蛋清水解物的氨基酸组成Table 3 Amino acid compositions of the egg white hydrolysates and native egg white

表4 天然蛋清及蛋清水解物的必需氨基酸组成Table 4 Essential amino acid composition of native egg white and the egg white hydrolysates

2.4 氨基酸评分

以1973年FAO/WHO组织提出的氨基酸模式[11]对产物进行必需氨基酸评分，结果如表5所示。天然蛋清的氨基酸评分值为55.1，而蛋清水解产物的氨基酸评分值为113.3，后者比前者提高了105.6%，此结果表明EMR酶解方法制备的水解物的氨基酸组成更加平衡。

天然蛋清和蛋清水解物的必需氨基酸的质量分数相差不大，而它们的氨基酸评分值相差较大，是因为：由于蛋白酶酶切位点的特异性，蛋白酶水解蛋清蛋白时使带有必需氨基酸(如蛋氨酸和半胱氨酸)的小肽从酶膜反应系统中分离出，使水解物中蛋氨酸和半胱氨酸的含量增加，从而导致水解物的氨基酸组成更均衡，氨基酸评分值提高。

表5 天然蛋清和蛋清水解物的氨基酸评分Table 5 Amino acid scores of native egg white and the egg white hydrolysates

陈丽花等[12]在评价中国对虾蛋白质的营养价值时发现，对虾肉蛋白质的氨基酸评分值为105。张赵英等[13]对大米蛋白和乳清蛋白进行氨基酸评分，结果分别为66和62；将两者复配后，复合米蛋白营养粉的氨基酸评分值提高，但只达到73。赵江等[14]对乳清浓缩蛋白和大豆分离蛋白进行氨基酸评分，它们的氨基酸评分值分别是66.3和48.3，两者复配后蛋白的氨基酸评分为71.4。由此可见，EMR酶法制备的蛋清水解物的氨基酸评分值远远高过其他蛋白粉或复配蛋白粉。因此，EMR酶法生产的蛋清水解物具有氨基酸组成平衡、富含小肽的特点，在开发适合胃肠道吸收障碍病人的营养保健品中有着广阔的应用前景。

3 结 论

本实验对EMR酶法制备得到的蛋清水解物进行营养评价，发现该水解物的游离氨基酸的质量分数仅为0.386%，含2～4个氨基酸残基的肽的质量分数占到近71%，水解物主要由小肽组成。通过氨基酸分析发现，EMR蛋清水解物所含的必需氨基酸占到氨基酸总量的44.8%，水解物的氨基酸评分值为113.3，比天然蛋清的氨基酸评分值提高了105.6%。该水解物易被人体吸收、氨基酸组成均衡，具有较高的营养价值，可广泛应用于营养保健食品生产中。

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Nutritional Evaluation of Egg White Hydrolysates Prepared Using an Enzymatic Membrane Reactor

YANG Wan-gen1，WANG Wei-dong1，SUN Yue-e1，WANG Zhang2，CHENG Yun-hui3
(1. College of Food Engineering, Xuzhou Institute of Technology, Xuzhou 221008, China；2. School of Food Science and Technology, Jiangnan University, Wuxi 214122, China；3. School of Chemical and Biological Engineering, Changsha University of Science and Technology, Changsha 410114, China)

TS253.9

A

1002-6630(2010)17-0364-04

2010-01-15

杨万根(1974—)，男，讲师，博士，研究方向为食品生物技术。E-mail：yangwangen08@163.com