Bacillus subtilisB2产1-脱氧野尻霉素(DNJ)发酵条件优化

朱运平，李秀婷，李里特

(1.北京工商大学化学与环境工程学院，北京 100048；2.中国农业大学食品科学与营养工程学院，北京 100083)

Bacillus subtilisB2产1-脱氧野尻霉素(DNJ)发酵条件优化

朱运平1，李秀婷1，李里特2

(1.北京工商大学化学与环境工程学院，北京 100048；2.中国农业大学食品科学与营养工程学院，北京 100083)

为探索制备含有1-脱氧野尻霉素(1-deoxynojimycin，DNJ)的降血糖功能性食品的新方法，以产DNJ的菌株Bacillus subtilisB2为初始菌株，以价廉的农产品加工副产物豆渣为原料，通过对发酵条件的优化，获得富含功能因子DNJ的发酵液。结果表明：接种量对α-葡萄糖苷酶抑制活性影响不明显，当接种量大于104个/mL时，发酵液的α-葡萄糖苷酶抑制活性均在20以上。而豆渣浓度、发酵温度、培养基初始pH值及发酵时间对发酵液α-葡萄糖苷酶抑制活性影响较大，在豆渣质量浓度30mg/mL，初始pH值6～8，发酵温度40℃的条件下发酵48h，发酵液表现出较高的α-葡萄糖苷酶抑制活性。以Bacillus subtilisB2发酵豆渣的发酵液为原料开发含DNJ的降糖功能食品，可以大大提高豆渣的利用价值，为降糖功能食品的开发利用开辟新途径。

1-脱氧野尻霉素；Bacillus subtilisB2；豆渣；降血糖；功能性食品

Abstract：To prepare a fermentation broth rich in 1-deoxynojimycin (DNJ) available for the development of hypoglycemic functional foods containing DNJ using soybean dregs, a low-cost byproduct of agricultural products processing, as fermentation substrate andBacillus subtilisB2 as fermentation strain, some fermentation conditions were optimized. The results indicated that the effect of inoculum size on theα-glucosidase inhibitory activity of fermentation broth was not significant. An inoculum size above 104CFU/mL resulted in aα-glucosidase inhibitory activity above 20. However, fermentation substrate concentration,medium initial pH and fermentation temperature and time had substantial effect on theα-glucosidase inhibitory activity of fermentation broth. After fermentation for 48 h under the conditions of fermentation substrate concentration 30 mg/mL, medium initial pH 6 － 8 and 40 ℃, a maximumα-glucosidase inhibitory activity was obtained.

Key words：1-deoxynojimycin;Bacillus subtilisB2; soybean dregs; hypoglycemic function; functional food

1-脱氧野尻霉素(1-deoxynojimycin，DNJ)是一种α-葡萄糖苷酶强抑制剂，在糖尿病的治疗及预防过程中有着重要作用，是目前糖尿病治疗用药米格列醇的合成前体[1]。DNJ不仅在医药领域具有广泛的应用前景，在食品领域的作用也日渐凸显。天然植物资源中，桑类(桑芽、桑叶、桑皮、桑根、桑籽等)各个组织及全蚕粉均含有一定量的DNJ，具有明显α-葡萄糖苷酶抑制效果，我国古代就把桑叶用于中医保健[2-3]。近年来，日本等国已经允许以桑叶为原料的食品作为降血糖的功能性食品在市场上销售[4]。但由于桑叶各个组织因DNJ含量的差异表现出对α-葡萄糖苷酶抑制效果存在一定的差异，同时，种植地区、桑树的品种、生长阶段都会对桑树各组织中有效成分DNJ含量产生影响[5]，因此，以桑蚕类组织为原料生产降血糖功能性食品时，其有效成分DNJ的含量难以控制。

笔者在前期研究中发现从我国传统发酵食品中分离得到的枯草芽孢杆菌Bacillus subtilisB2具有产DNJ的能力，进而提出了采用微生物发酵法制备含有DNJ的降血糖功能性食品的方法[6-7]。Bacillus subtilisB2产DNJ的最佳发酵条件有待进一步探索，因此，本实验将对其发酵过程中的培养基浓度、初始pH值、发酵温度、接种量、发酵时间等进行研究。

豆渣是大豆加工产品如豆奶或豆腐加工过程中的副产品，中国、阿根廷、巴西、美国、日本等国家每年豆渣的产量很大[8-10]。豆渣中含有多种功能性成分，如膳食纤维、大豆蛋白、多糖、异黄酮、皂苷等，具有丰富的营养价值[11]。但由于豆渣含水量较高、保质期短，这使得豆渣的利用受到一定的限制，大部分豆渣作为动物饲料直接喂养动物或者焚烧掉或者作为废弃物堆放，不做任何利用，这造成了豆渣资源的极大浪费[12]。为了对豆渣进行综合利用，本研究选取豆渣作为Bacillus subtilisB2的初始培养基。

1 材料与方法

1.1 菌种

枯草芽孢杆菌(B.subtilisB2)由中国农业大学食品科学与营养工程学院李里特实验室筛选。先在Luria-Bertani(LB)培养基上活化16h，调整菌液浓度至106个/mL，作为豆渣发酵的菌悬液。

1.2 材料与试剂

大豆(小粒6号，2009年7月收获)购于吉林省农业科学院。以小粒6号大豆为原料在实验室制备豆渣(水分含量85%、粗蛋白质量分数3.65%、粗脂肪质量分数1.37%、粗纤维质量分数9.22%、其他物质质量分数0.76%)。

α-葡萄糖苷酶(Rat intestinal acetone powders)、4-硝基苯-α-D-吡喃葡萄糖苷(4-nitrophenylα-D-glucopyranoside，4-NPG) Sigma公司；其他化学试剂均为分析纯。

1.3 发酵条件对发酵液α-葡萄糖苷酶抑制活性的影响

1.3.1 豆渣质量浓度对发酵液α-葡萄糖苷酶抑制活性的影响

以豆渣作为单一营养元素，对豆渣的添加浓度进行选择，添加质量浓度分别为：10、20、30、40、50、60mg/mL。

1.3.2 培养基初始pH值对发酵液α-葡萄糖苷酶抑制活性的影响

以0.1mol/L柠檬酸或氢氧化钠溶液调节培养基的初始pH值为：5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、10.0，在上述培养条件下，摇瓶培养48h后测定α-葡萄糖苷酶抑制活性。

1.3.3 发酵温度对发酵液α-葡萄糖苷酶抑制活性的影响

采用不同温度20、25、30、35、40、45、50℃对菌株进行摇瓶发酵培养，培养48h后测定α-葡萄糖苷酶抑制活性。

1.3.4 接种量对发酵液α-葡萄糖苷酶抑制活性的影响

将种子培养液稀释到一定浓度，使得培养基中菌种初始浓度为103、104、105、106、107个/mL，摇瓶培养48h后测定α-葡萄糖苷酶抑制活性。

1.3.5 发酵时间对发酵液α-葡萄糖苷酶抑制活性的影响

发酵培养时间分别为：0、12、24、36、48、60、72、84、96h。测定发酵液的α-葡萄糖苷酶抑制活性。

1.4 α-葡萄糖苷酶抑制活性的测定[13]

因DNJ的含量与α-葡萄糖苷酶抑制活性存在正相关关系，因此，在发酵过程中通过检测发酵液的α-葡萄糖苷酶抑制活性初步判断DNJ的浓度。在96孔酶标板上，每个样品经过7次连续2倍稀释，得到一系列样品稀释液。经过稀释的样品中加入50μLα-葡萄糖苷酶溶液(25mg/mL)，50μL 4-PNPG (0.9133 mg/mL)及 120μL 0.5mol/L的磷酸缓冲液(pH6.7)。混匀后在37℃培养箱中反应45 min。加入50μL碳酸钠溶液(0.67mol/L)终止反应，在波长405nm下用酶标仪(Model 550酶标仪，BIORAD Laboratories)测定吸光度。α-葡萄糖苷酶的抑制活性通过读出的吸光度计算斜率值，用斜率表示抑制活性的高低。斜率越大，说明样品的抑制活性越强，发酵液中有效成分DNJ的含量越高。

2 结果与分析

2.1 豆渣质量浓度对发酵液α-葡萄糖苷酶抑制活性的影响

笔者在前期研究过程中，发现在LB培养基中添加豆渣、豆粉及淀粉这些附加培养物，发酵液的α-葡萄糖苷酶活性比单纯用LB培养基显著提高[6]。考虑到淀粉不适合作为餐后高血糖患者的饮食，因此，虽然淀粉能够提高发酵液α-葡萄糖苷酶抑制活性，还是建议尽量不向起始培养基中加入淀粉。大豆粉和豆渣也能显著提高发酵液α-葡萄糖苷酶抑制活性，考虑到豆渣的成本较大豆粉低很多，因此本研究中采用豆渣作为Bacillus subtilisB2发酵唯一营养源进行发酵，并试图为豆渣的开发利用开辟一条新途径。

从图1可以看出，豆渣质量浓度对发酵液的α-葡萄糖苷酶抑制活性的影响明显，随着豆渣质量浓度的增大，发酵液的α-葡萄糖苷酶抑制活性也随之增加。豆渣质量浓度从10mg/mL增加到30mg/mL的过程中，发酵液α-葡萄糖苷酶抑制活性从6.9迅速增加到21.8。当豆渣质量浓度高于30mg/mL时，继续增大豆渣质量浓度，发酵液α-葡萄糖苷酶抑制活性增加的速度放缓，最高抑制活性达到25.6。

图1 豆渣质量浓度对发酵液α-葡萄糖苷酶抑制活性的影响Fig.1 Effect of soybean dregs concentration on theα-glucosidase inhibitory activity of fermentation broth

以豆渣为唯一营养源，即Bacillus subtilisB2生长的碳源及氮源均来源于豆渣。豆渣中含有24%左右的大豆蛋白可以作为菌体生长的良好氮源，大豆低聚糖、单糖等可以作为碳源[8,11]。同时，豆渣中含有丰富的纤维素，包括可溶性纤维和不溶性纤维，Bacillus subtilisB2在生长过程中可以水解部分纤维素成低聚糖或单糖，作为生长的碳源。本实验中改变豆渣的浓度，也就是改变初始发酵液中碳源及氮源的浓度，这通常会对菌体生长及代谢产生较大的影响[14]。因此，豆渣浓度发生变化，发酵液的α-葡萄糖苷酶活性也会发生改变。

2.2 培养基初始pH值的影响

图2 pH值对发酵液α-葡萄糖苷酶抑制活性的影响Fig.2 Effect of medium initial pH on theα-glucosidase inhibitory activity of fermentation broth

由图2可见，培养基初始pH5时发酵液的抑制活性仅为1.2，几乎没有抑制活性。当培养基初始pH5.5时，发酵液对α-葡萄糖苷酶活性具有一定的抑制作用，达到10.4。随着培养基初始pH值的增加，发酵液的抑制作用也增强，当初始pH7时，抑制活性最高达到22.9。随着培养基初始pH值进一步增加，发酵液抑制活性又逐渐下降，到pH10时，抑制活性为7.7。培养基初始pH值调节在酸性范围内时，pH值的变化对抑制活性的影响显著，在pH值低于5.5的环境下，最终发酵液对α-葡萄糖苷酶的抑制活性也较低，这可能是因为低pH值容易抑制细菌的生长，进而影响其产生α-葡萄糖苷酶抑制因子的能力。在碱性范围内，发酵液抑制活性的变化趋势相对较缓慢。总的说来，初始pH值在6～8之间，发酵液的α-葡萄糖苷酶抑制活性较高，维持在18以上。

2.3 发酵温度的影响

图3 发酵温度对发酵液α-葡萄糖苷酶抑制活性的影响Fig.3 Effect of fermentation temperature on theα-glucosidase inhibitory activity of fermentation broth

由图3可见，40℃发酵所得发酵液对α-葡萄糖苷酶抑制活性最强，达到23.4。在30～45℃范围内发酵液的抑制活性均较高，在14.7以上。但当温度低于30℃及高于45℃时，发酵液的抑制活性降低很快，20℃及50℃时的抑制活性分别是最高抑制活性的31.3%和4.8%。在温度较低的情况下，菌体生长缓慢，因此当发酵进行48h后发酵液的抑制活性仍然不高。本研究所用菌种为枯草芽孢杆菌，就菌种本身来说因其具有芽孢，是能够耐受高温的，但本实验发现当温度增到50℃时，发酵液的抑制活性就显著降低，这可能是因为：枯草芽孢杆菌虽然能在高温环境下存活，但其正常的生长繁殖能力却受到高温条件的影响而降低，另一方面，高温环境也可能会改变正常菌株合成α-葡萄糖苷酶抑制因子的能力[15]。

2.4 接种量的影响

图4 接种量对发酵液α-葡萄糖苷酶抑制活性的影响Fig.4 Effect of inoculum size on theα-glucosidase inhibitory activity of fermentation broth

由图4可见，当接种量大于104个/mL时，发酵液的α-葡萄糖苷酶抑制活性均在20以上，不同的接种量对抑制活性影响差别不大，当接种量为103个/mL时，发酵液的α-葡萄糖苷酶抑制活性不高，为最高抑制活性的70%，说明接种量103个/mL太小，一定程度上影响了菌株的生长及α-葡萄糖苷酶抑制因子的生成。在后续实验中将选择接种量106个/mL。

2.5 发酵时间的影响

图5 发酵时间对发酵液α-葡萄糖苷酶抑制活性的影响Fig.5 Effect of fermentation time on theα-glucosidase inhibitory activity of fermentation broth

由图5可见，当发酵进行到12h时，发酵液具有一定的α-葡萄糖苷酶抑制活性，随着发酵时间的延长，抑制活性也增加，发酵进行到48h时，抑制活性达到22.8，进一步延长发酵时间，抑制活性增长速度缓慢。发酵进行到96h时，抑制活性达24.3。

3 结 论

本研究对Bacillus subtilisB2产DNJ的液体发酵条件进行研究，结果表明：豆渣浓度、发酵温度、培养基初始pH值及发酵时间对发酵液的α-葡萄糖苷酶抑制活性影响较大。在豆渣质量浓度30mg/mL，初始pH6～8，发酵温度40℃的条件下发酵48h，发酵液表现出较高的α-葡萄糖苷酶抑制活性，即发酵液中DNJ含量较高。在本研究结果的基础上，有望通过进一步研究得到含稳定有效降血糖成分的功能性食品。同时，将发酵豆渣开发成特殊用途的食品，可以大大提高豆渣的利用价值，为豆渣的开发利用开辟新途径。

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Optimization of Fermentation Conditions for 1-Deoxynojimycin (DNJ) Production byBacillus subtilisB2

ZHU Yun-ping1，LI Xiu-ting1，LI Li-te2
(1. School of Chemical and Environmental Engineering, Beijing Technology and Business University, Beijing 100048, China；2. College of Food Science and Nutritional Engineering, China Agricultural University, Beijing 100083, China)

TQ920.1

A

1002-6630(2010)17-0290-04

2010-06-09

“十一五”国家科技支撑计划项目(2006BAD27B09)；北京工商大学青年启动基金项目；北京市优秀人才项目；国家自然科学基金项目(31071511)

朱运平(1980—)，女，讲师，博士，研究方向为功能性食品。E-mail：zhuyp@th.btbu.edu.cn