HPLC测定健胃消炎颗粒中芍药苷的含量

林爱琴，蒋建霞

（1.江苏苏中药业集团股份有限公司，江苏姜堰 225500；2.南京医科大学第一附属医院消化科，江苏南京 210029）

健胃消炎颗粒收载于《卫生部药品标准》中药成方制剂第17册，由党参、茯苓、白术等十二味药物组成；具有健脾和胃，理气活血的功效，中医临床用于脾胃不和所致的上腹疼痛、痞满纳差以及慢性胃炎见上述证候者。原标准仅有性状、鉴别、检查项，没有含量测定。笔者对原标准进行提高，结合处方组成和制备工艺，选择芍药苷作为含量测定的指标成分。

1 仪器与试药

1.1 仪器

Agilent 1100 Series高相液相色谱仪；Sartorius BP210S分析天平；Sartorius BS21S分析天平；KQ-250DE型医用数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）。

1.2 试药

芍药苷对照品（中国药品生物制品检定所，批号：110736-200321）；健胃消炎颗粒（无糖型批号：040210-1、05020104、05050502；含糖型批号 040319-1、05010405、05042703）；缺白芍、赤芍的阴性样品（江苏苏中药业集团股份有限公司）；乙腈为色谱纯，水为纯化水，其他试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：luna-C18（4.6 mm×150 mm，5 μm）；流动相：乙腈-水（13∶87）；检测波长：230 nm；流速 1.0 ml/min；进样量：10 μl；柱温：室温。

2.2 提取方法的选择

参照文献用50%甲醇溶液为提取溶剂，以A-提取方式[超声（频率 80 kHz,功率 100 W）、加热回流]、B-提取时间（40、60 min）和 C-提取次数（1、2 次）为影响因素进行正交试验，结果见表1。

表1 提取方法的选择试验结果Tab.1 Results of orthogonal test for extracting

由上表结果可以看出，最佳提取条件为A1B1C2，综合考虑提取时间、成本及工作效率，确定本品的提取方法：超声（频率80 kHz,功率100 W）提取1次、提取时间60 min。

2.3 对照品溶液的制备

精密称取芍药苷对照品10.08 mg，置50 ml量瓶中，加50%甲醇溶液使溶解并稀释至刻度，摇匀，作为对照品贮备液。吸取2.5 ml对照品贮备液至10 ml量瓶中，用甲醇溶液定容至刻度，摇匀，作为对照品溶液。

2.4 供试品溶液的制备

取装量差异项下的本品，研细，取适量（无糖型0.5 g、含糖型2.0 g），精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入50%甲醇溶液 50 ml，称定重量，超声（频率 80 kHz,100 W）处理60 min，取出，放至室温，称重，用50%甲醇溶液补足减失的重量，摇匀，用0.45 μm的微孔滤膜滤过，取续滤液，作为供试品溶液。

2.5 阴性样品干扰试验

按健胃消炎颗粒处方制备缺白芍、赤芍的阴性对照颗粒，按照供试品溶液的配制方法制得阴性样品溶液，在选定的色谱条件下进样测定，记录色谱图，结果阴性样品图谱在芍药苷对照品色谱峰相应位置处未检出色谱峰，表明处方中其他药物对芍药苷的测定无干扰，该方法有较好的专属性。HPLC色谱图见图1。

2.6 线性关系考察

分别精密量取“2.3”项下芍药苷对照品溶液适量，用50%甲醇溶液稀释制成浓度为 10.08、25.20、50.40、100.80、201.60 μg/ml的对照品溶液，摇匀。分别吸取10 μl，按上述色谱条件测定色谱峰面积，以对照品进样量（μg）为横坐标，峰面积为纵坐标，计算回归方程，结果表明芍药苷进样量在0.1008～2.0160 μg范围内，呈良好的线性关系。回归方程为A=1111.1742C-2.6489（r=1.0000）。 见表 2。

2.7 精密度试验

精密吸取“2.3”项下对照品溶液 10 μl，重复进样 6次，按上述色谱条件测定色谱峰面积，RSD为0.40%，结果表明该法精密度良好。见表3。

2.8 最小检测限及最小定量限

取浓度为10.08 μg/ml的芍药苷对照品溶液用50%甲醇稀释，按S/N（信噪比）≈3，确定芍药苷的最小检测限为1.5 ng；按S/N（信噪比）≈10确定芍药苷的最小定量限为5.0 ng。

表2 线性关系考察结果（n=5）Tab.2 Result of inspection on linear relation(n=5)

表3 精密度试验（n=6）Tab.3 Test of precision(n=6)

2.9 稳定性试验

取供试品溶液，分别在 0、1、3、6、9、12、24 h 时进样，记录峰面积，计算相对标准偏差，结果表明供试品溶液室温放置24 h稳定。见表4。

表4 稳定性试验Tab.4 Test of stability

2.10 重复性试验

取样品（批号：05050502）0.5 g（6 份），按照“2.12”项下方法操作，计算芍药苷含量，结果表明该法重复性良好。结果见表5。

2.11 回收率试验

取健胃消炎颗粒（批号：05050502）细粉0.26 g，共6份。精密称定，置具塞锥形瓶中，分别精密加入芍药苷对照品溶液（浓度：0.1271 mg/ml）8、8、10、10、12、12 ml，再分别精密加入 50%甲醇溶液 42、42、40、40、38、38 ml，称定重量，超声（频率80 kHz,100 W）提取60 min，取出，放至室温，称重，用50%甲醇溶液补足减失的重量，摇匀，用0.45 μm的微孔滤膜滤过，取续滤液，依法测定，计算回收率，结果表明该法加样回收率良好。见表6。

表5 重复性试验（n=6）Tab.5 Test of repeatability(n=6)

表6 回收率试验（n=6）Tab.6 Results of recovery test(n=6)

2.12 含量测定方法

取6批样品，照“2.4”项下方法制备供试品溶液，精密量取供试品溶液10 μl注入液相色谱仪，记录色谱图，以峰面积按外标法计算相应健胃消炎颗粒中芍药苷的含量，结果见表7。

表7 样品含量测定结果（%，n=6）Tab.7 Content determination results of samples(%,n=6)

3 讨论

3.1 流动相选择

参照文献[1-5]对乙腈-水、乙腈-磷酸溶液、乙腈-磷酸盐缓冲液等3个系统进行了比较。结果该样品在乙腈-水（13∶87）系统中分离效果理想。

3.2 提取溶剂的选择

文献报道[1-5]，芍药苷的提取溶剂有甲醇、含水甲醇及稀乙醇，预试验的结果显示，与50%甲醇溶液比较，以甲醇溶液、稀乙醇溶液提取，芍药苷含量测定结果偏低，且峰形不理想，有明显的前延或拖尾现象。由此可见，以50%甲醇溶液作为提取溶剂比较适宜，且在此色谱条件下，芍药苷与其他成分的分离度较好，柱效较高，保留时间适中。

3.3 提取条件的优化

正交试验结果显示，经超声提取其芍药苷含量比经回流提取的高出0.1%，表明超声和回流对提取率几乎没有影响，考虑到超声提取简单易行，故以超声为本品的提取方式；提取时间40 min比60 min高4%，提取2次比1次高2%，综合以上各因素，确定本品的提取方法为超声提取1次，提取时间60 min。为验证本方法的可靠性，又进行了提取完全性和加样回收试验：将超声提取40 min、1次的滤渣再同法提取一次进样测定，其结果含量为0.1408 mg/g，提取率为97.2%，已基本提取完全；加样回收率为100.59%，再次验证了提取条件的可靠性。

3.4 指标性成分的确定

根据有效成分或指标性成分清楚、无干扰的原则，结合健胃消炎颗粒的方药组成及制备工艺，本品可供选择的测定药味有：白芍、赤芍、大黄、丹参，经预试验显示，制剂中丹参酮ⅡA的含量极低，丹酚酸B的量也较少且阴性有干扰；大黄的成分相对清楚，但与本品的功能主治有一定的距离，不适宜作为本品的指标性成分；近年来，关于芍药苷的基础药学研究已比较成熟，且在本品中含量高、无干扰，提取工艺简单，柱效高。再结合中医基础理论，白芍、赤芍具有养血调经，平肝止痛的作用，为健胃消炎颗粒的有效成分之一，故以芍药苷作为本品的测定指标。关于芍药苷属于白芍、赤芍共有成分的问题，在《中国药典》收载的中药制剂质量标准中也有类似情况，如黄连与黄柏测小檗碱、枳实与枳壳测橙皮苷、川芎与当归测阿魏酸等。

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