普通小麦中一氧化氮相关因子(TaNOA)编码基因的克隆和分子生物学分析

郝丽芳，余春梅，李斌，王道文

1 中国科学院遗传与发育生物学研究所，北京 100101 2 中国科学院研究生院，北京 100049 3 南通大学生命科学学院，南通 226007

普通小麦中一氧化氮相关因子(TaNOA)编码基因的克隆和分子生物学分析

郝丽芳1,2*，余春梅1,3*，李斌1,2，王道文1

1 中国科学院遗传与发育生物学研究所，北京 100101 2 中国科学院研究生院，北京 100049 3 南通大学生命科学学院，南通 226007

一氧化氮是动植物体内重要的信号分子。本研究利用同源克隆技术从六倍体普通小麦中获得一个一氧化氮相关因子(TaNOA)编码基因的全长基因组和cDNA克隆。该基因具有13个外显子和12个内含子，与拟南芥以及水稻中同源基因结构相似。根据cDNA推导的氨基酸序列与拟南芥AtNOA1的序列一致性达60%以上，具备P-环GTPase G4-G5-G1-G2-G3的排列特征和保守的序列。对其中2个内含子的测序分析表明在六倍体小麦中TaNOA至少有3个成员。进一步用中国春小麦缺体-四体材料将这3个TaNOA基因成员分别定位在第六同源群的6A、6B和6D染色体上，本研究中获得的成员定位于6B染色体上，因此将其命名为TaNOA-B1。原生质体表达实验表明，TaNOA-B1可能定位在线粒体中。TaNOA基因在小麦根、叶片中表达较高，在幼穗和小花中有少量表达，茎中几乎检测不到表达。TaNOA的转录本水平还因脱落酸或盐处理而上升，表明它可能参与小麦对非生物胁迫的反应。本研究为进一步克隆六倍体小麦中TaNOA的其他成员及研究该基因在小麦中的功能奠定了基础。

普通小麦，一氧化氮相关因子(NOA)，TaNOA1-B1，防御反应

Abstract:Nitric oxide(NO)is an important signaling molecule with diverse physiological functions in both animal and plant cells.In this work, we isolated the full-length cDNA and genomic DNA sequences of TaNOA-B1 encoding a putative NO associated(NOA)factor in common wheat.Bioinformatic analysis showed that TaNOA-B1 possessed a similar intron/exon structure as its orthologous genes in Arabidopsis and rice.The amino acid sequence deduced from TaNOA-B1 was more than 60% identitical to those of Arabidopsis and rice NOA1 proteins.The primary structure of TaNOA-B1 contained the zinc finger and P-loop GTPase motifsconserved in Arabidopsis and rice NOA1 proteins.There existed at least three NOA gene members in common wheat, which were mapped to homoeologous group six chromosomes 6A, 6B and 6D, respectively.TaNOA-B1 investigated in this work was located on chromosome 6B.The transcripts of TaNOA members were found mainly in leaves.TaNOA-B1-GFP fusion protein may be located in mitochondria.TaNOA transcript level was up-regulated by abscisic acid(ABA)or NaCl treatments, indicating that TaNOA might be involved in wheat responses to abiotic stresses.

Keywords:common wheat, nitric oxide associated(NOA), TaNOA-B1, abiotic stress response

一氧化氮(Nitrite oxide，NO)作为重要的信号分子参与动物的神经传导、肌肉伸缩、激素分泌、细胞凋亡、离子通路活性以及免疫反应等重要生理过程[1]。动物中内源NO的合成主要是由一氧化氮合酶(Nitric oxide synthase，NOS)催化产生的。在NADPH作为电子供体和O2参与下，NOS将L-精氨酸转化为中间产物Nw-羟基-L-精氨酸，最终生成NO和L-瓜氨酸。该反应需要核黄素二核苷酸(FAD)、核黄素单核苷酸(FMN)、四氢生物喋呤(BH4)等辅助因子的参与[1]。

植物中有关 NO的发现和研究相对滞后。直到1998年Delledonne等[2]和Durner等[3]报道NO在植物防御反应中作为重要的信号分子起作用，NO在植物中的研究才迅速展开。除了防御反应外，NO还参与调控植物种子发芽、根系生长、维管束的分化、气孔运动、开花和抗逆反应等过程[4]。目前认为有两种途径参与植物内源 NO的合成。一是通过硝酸还原酶(Nitrate reductase，NR)介导的还原途径产生NO，但该酶产生NO的活性较低。二是认为植物细胞存在类似动物中的NOS参与的NO合成途径[1,4]。一些生理生化分析(如检测植物提取物中的NOS酶活性或外源施加NO的前体物质硝普钠检测NO在植物中的积累)表明植物具备NOS酶活，存在类似动物细胞中的 NO合成途径[1,4]。但直到Chandok等[5]和 Guo等[6]分别首次报道了烟草和拟南芥的NOS基因，在遗传学和分子生物学水平上对植物 NOS基因的研究才有了突破。但拟南芥 NOS基因(AtNOS1)的突变体 Atrif1 对膦胺霉素(Fosmidomycin)抗性不能通过 NO 得到恢复[7]。Zemojtel等[8]分离了 AtNOS1在水稻(GenBank Accession No.Q6YPG5)和玉米(GenBank Accession No.AY110367)中的同源基因，并进行原核表达纯化，体外生化分析却没有检测到这些蛋白的NOS活性。因此，研究者认为AtNOS1可能并不直接合成NO，但鉴于Atnos1突变体中NOS的活性下降，NO含量降低等表型，Crawford等[9]将AtNOS1重新命名为 AtNOA1。Vardi等[10]研究硅藻Phaeodactylum tricornutum中与AtNOA1同源的基因PtNOA时也发现过量表达PtNOA的材料中，NO的水平是野生型的 1.8～2.4倍。Li等[11]研究表明，AtNOA1介导的NO合成参与Ca2+、G蛋白和H2O2信号通路调节拟南芥叶片气孔的关闭。这些实验表明，尽管AtNOA1及其同源基因不直接参与NO的合成，但确实影响植物体内NO含量。进一步研究表明AtNOA1与枯草芽孢杆菌 Bacillus subtilis细菌中的YqeH蛋白同源，具有GTPase的活性，参与70S核糖体的组装[12-14]。

由于NOA具有GTPase活性而且影响植物细胞中 NO的含量，研究其编码基因的分子遗传学有助于更深入地了解NOA发挥功能的机理。在作物中研究NOA，有利于揭示其是否参与重要农艺性状的调控，为作物遗传改良研究提供信息。到目前为止，尚未见小麦中有关NOA基因的研究报道，本研究旨在鉴定和分离六倍体普通小麦中的NOA基因，了解其表达特征，并对其生物学功能做一些探讨。

1 材料与方法

1.1 材料

栽培品种小偃54，中国春缺体-四体系材料(总计21份)，六倍体小麦A组(乌拉尔图小麦Triticum urartu，AA， 2n = 2x = 14，IE29-1)和D组(粗山羊草Aegilops tauschii，DD，2n = 2x = 14，As67和As91品系)祖先物种，四倍体硬粒小麦(T.turgidum ssp.durum，AABB，2n = 4x = 28，Langdon品种)，以上实验材料均由中国科学院遗传与发育生物学研究所植物细胞与染色体国家重点实验室保存。

1.2 酶和试剂

LA DNA 聚合酶(含 GC buffer)，dNTPs，内切酶和DNA marker购自大连宝生物公司。T载体购自Promega公司。胶回收试剂盒购自鼎国生物技术有限公司；质粒提取试剂盒购自博大泰克生物技术公司。所用其他化学试剂均来自Amresco公司。

1.3 基因组DNA的提取

小偃54和中国春缺体-四体材料于25℃ 培养2周后，用CTAB方法[15]提取基因组总DNA(Genomic DNA，gDNA)。

1.4 RNA提取及cDNA的合成

在温室(25℃)培养小偃 54，分别取 2周幼苗的根和叶片、孕穗期植株的茎和幼穗以及开花期植株的小花等材料。用 TRIzol®(Invitrogen公司)试剂，按试剂说明手册制备总RNA。总cDNA的合成按 M-MLV 逆转录酶(Promega公司)反转试剂盒说明书进行。

1.5 5′-RACE 和 3′-RACE

通过生物信息学分析发现一条小麦表达序列标签(Expressed sequence tag，EST)，序列编号为BF201083(http://wheat.pw.usda.gov/wEST/)，与拟南芥NOA基因的编码序列具有高度相似性。在此基础上，设计基因特异引物(未显示)进行 5′-RACE和3′-RACE。5′-RACE 实验按照 SMARTTM RACE cDNA Amplification Kit (Clontech)说明书进行。3′-RACE 操作按照 3′-Full Race Core Set(TaKaRa 公司)说明书进行。

1.6 TaNOA基因的克隆及其全长cDNA的获得

根据1.5中获得的序列设计了扩增TaNOA的全长引物P1和P2(表1)。分别以小麦叶片总的基因组DNA和cDNA为模板进行PCR扩增，PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳后，切胶回收，并进行T/A克隆。阳性克隆送Invitrogen公司测序。所得的克隆序列为2次独立PCR和3个以上质粒测序的结果。

1.7 普通小麦 NOA基因拷贝数的确定和染色体定位

根据测序结果，结合生物信息学分析拟南芥、水稻和小麦等物种中NOA基因的结构，设计了在水稻和小麦中保守的跨内含子(Conserved and intron flanking，CIF，表1)引物分别扩增第3内含子(内含子长度在拟南芥、水稻和小麦间变化不明显)和12内含子(在上述3个物种间内含子的长度变化较大)，且扩增产物的长度利于毛细管电泳(介于100～600 bp)。PCR产物经过T/A克隆后，阳性克隆随机测序，根据片段的序列差异推断普通小麦中NOA基因的拷贝数。PCR扩增反应的模板为从小偃54、IE29-1、As67、As91、Langdon制备的基因组DNA样品。荧光标记引物CIF P3与P4配对，PCR产物经过毛细管电泳分离，在中国春及其缺体-四体材料中对TaNOA基因进行染色体定位研究。

1.8 半定量PCR分析TaNOA的表达模式

设计保守引物TaNOA P3和P4，对TaNOA组织器官表达模式进行分析。内参基因为普通小麦β-tubulin(GenBank Accession No.TAU76745)基因特异引物(表1)。

1.9 原生质体表达载体的构建和拟南芥原生质体的转化

通过PCR扩增、酶切回收和DNA连接将得到的TaNOA-B1基因的全长cDNA克隆到p163-GFP载体(含35S：GFP表达框[16])中GFP编码序列的上游，制备了35S:TaNOA-B1-GFP表达载体，所用引物见表 1，经测序验证为正确的质粒用于原生质体的转化。温室生长良好的拟南芥野生型(Columbia ecotype)叶片用于制备原生质体和转化[17]。转化后的原生质体于Olympus FV500激光共聚焦显微镜下观察并拍照。

表1 本研究中所用的引物Table 1 Primers used in this study

1.10 脱落酸(ABA)和盐处理

将常规培养的小麦种子萌发 3 d的幼苗转入水培体系(改良的1/4 Hoaglands培养液)中。植株生长2周为二叶一心期时，对其进行相应的胁迫处理。处理方法如下：将小麦幼苗分别移到含有20 µmol/L ABA 或 150 mmol/L NaCl 的新鲜 1/4 Hoaglands培养液中，处理4 h和10 h时分别取幼苗的地上部和地下部，液氮速冻后保存在−70°C冰箱备用。总RNA提取、cDNA合成以及半定量RT-PCR试验参照上述方法进行，所用PCR引物列于表1。

2 结果

2.1 TaNOA基因的cDNA和gDNA克隆以及基因结构分析

通过生物信息学分析和分子克隆方法，在普通小麦品种小偃54中，获得了一个具有全长编码区的NOA基因的cDNA和基因组克隆。通过序列比对分析，所获得的基因组克隆编码区的序列与所获得的cDNA克隆的序列是一致的，用该cDNA 5′特异序列的亚基因组表达模式分析表明，只在含有B亚基因组的四倍体和六倍体小麦中表达(结果未显示)，结合2.2结果，将该基因命名为TaNOA-B1。比较拟南芥和水稻NOA以及TaNOA-B1的基因结构，发现3个物种中NOA的结构非常保守，均由13个外显子和12个内含子组成(图1A)。基因在物种间长度上的差异主要是内含子长度上的变化。

TaNOA-B1与AtNOA1的序列一致性达到了61%，与OsNOA序列一致性达到了82%。进一步分析表明，TaNOA-B1具有典型的P-环GTPase酶的特点，即具有G4-G5-G1-G2-G3倒置排列的GTP结合基序(图1B)[10,12-13,17]；在N端具有CX2CX25-35CX2C锌指结合基序(图1B)，表明 TaNOA-B1及其同源蛋白可能是一类能与核酸结合的蛋白。氨基酸序列显示出的特征表明TaNOA-B1应该具有生物学功能。

2.2 六倍体普通小麦 NOA基因拷贝数的分析和染色体定位

为了明确六倍体普通小麦中NOA基因的拷贝数，根据图1A基因结构的特点设计引物，利用PCR分别扩增跨NOA含内含子-3(CIF P1和P2配对)和内含子-12(CIF P3和P4配对)的区域，并进行测序分析(材料与方法1.7)。结果显示小偃54中NOA基因intron-3和intron-12的序列均可分为3种类型(表2)。

对跨intron-12的3种序列分析表明，intron-12-1与A组供体材料IE29-1(序列结果未显示)中扩增的序列一致，第2类序列(intron-12-2)与本研究所获得的全长NOA的gDNA序列中内含子-12一致(489 bp)，而第3类序列intron12-3与从D组供体材料(As67和As91)扩增的序列一致(结果未显示)。利用跨内含子12的荧光标记的引物扩增A组供体乌拉尔图小麦(T.urartu，IE29-1)，D组供体粗山羊草(Ae.Tauschii，As67和As91)，四倍体硬粒小麦(T.turgidum ssp.durum，Langdon)，结合毛细管电泳的方法对片段的类型进行分析。结果表明在二倍体供体物种(A和D组)、四倍体中分别有1种和2种片段(图2A)。利用该引物扩增中国春及其缺体-四体材料，并进行片段分析。结果表明缺少6A、6B和6D染色体的材料中分别缺少了540 bp、489 bp和544 bp的条带(图2B)，而其余材料中的带型与野生型中国春(CS)没有区别(结果未显示)。结合测序以及染色体定位结果，表明在六倍体小麦中，NOA有3个成员，分别位于6A、6B和6D染色体上，本研究中获得的全长NOA序列来自6B染色体，因此将其命名为TaNOA-B1。

2.3 TaNOA的组织器官转录模式分析

根据 TaNOA-B1以及 EST克隆(结果未显示)的序列，设计保守引物扩增3个TaNOA成员(表1)，且为了避免基因组DNA污染，设计的引物扩增产生的PCR片段覆盖了2个内含子片段。从图3中可以看出，TaNOA转录本水平在根和叶片中表达量比较高，在茎中几乎检测不到，在生殖器官(幼 穂 和花)中相对较低。

2.4 TaNOA-B1蛋白的亚细胞定位

图1 拟南芥(AtNOA1)、水稻(OsNOA)和普通小麦(TaNOA-B1)NOA基因结构以及氨基酸序列的多重比对分析Fig.1 Structure of Arabidopsis, rice, and common wheat NOA genes and the multiple alignment of the deduced amino acid sequences of three NOA proteins.(A)The structure of NOA genes from Arabidopsis(AtNOA), rice(OsNOA), and common wheat(TaNOA-B1).(B)Multiple alignment of the deduced amino acid sequences of three plant NOA proteins.The conserved zinc finger motif(CX2CX25-35CX2C)is underlined.The sequence elements forming the conserved P-loop GTPase motif are boxed.Asterisks mark the presence of identical residues among the compared proteins.The conserved and semi-conserved substitutions are indicated by the symbols “:” and “.”, respectively.

为了研究 TaNOA-B1蛋白的亚细胞定位，构建了其与 GFP的融合蛋白的表达框，转化拟南芥叶片的原生质体，通过这种瞬时表达体系获得TaNOA-B1的亚细胞定位信息。从图4A可以看出 TaNOA-B1-GFP融合蛋白在拟南芥原生质体中呈小点状分布，而叶绿体呈较大的片状分布(图4B)，利用荧光显微镜同时观察两种荧光的图像发现融合蛋白多分布在叶绿体的周围，但两者并不重合(图 4D)。TaNOA-B1-GFP融合蛋白的这种分布特征与线粒体的定位非常相似。因此，TaNOA-B1-GFP融合蛋白不定位于叶绿体。根据线粒体的分布特征，推测TaNOA-B1很有可能定位在线粒体中。

图2 祖先物种和六倍体小麦中NOA成员数以及其染色体定位分析Fig.2 NOA copy number in ancestral species of common wheat and chromosomal assignment of TaNOA genes in hexaploid wheat.The fragments specific for individual NOA gene members were amplified by PCR, followed by separation via capillary electrophoresis.NOA gene specific peaks are marked by arrows.The minor peaks labeled by asterisks are due to DNA size standards.The scale on the horizontal axis indicates fragment size(number of nucleotides), which was determined using the DNA size standards co-separated with the PCR products.The genotypes used in this analysis are provided in the brackets.The data shown are representative of five independent experiments.(A)Analysis of NOA copy number in the ancestral species(T.urartu, Ae.tauschii, T.turgidum ssp.durum)of common wheat by fragment analysis.(B)Chromosomal assignment of TaNOA genes in hexaploid wheat.The templates for PCR were prepared from Chinese Spring(CS), the nulli-tetrasomic(NT)lines of CS.Compared to the presence of all three NOA specific fragments in CS, the fragments were specifically absent from the NT lines lacking chromosomes 6A(N6AT6B),6B(N6BT6A), 6D(N6DT6A).The three NOA specific fragments were all amplified in the NT lines lacking other groups(i.e.1, 2, 3,4, 5 and 7)of chromosomes(data not shown).

2.5 对ABA和盐处理的反应

有研究表明在面临外界的环境胁迫时，小麦中的NOS活性有被诱导上调的现象[18]，说明NOS可能参与了小麦对逆境的应答反应。为了明确本研究中分离的TaNOA基因成员是否参与小麦抗逆过程，对经过20 µmol/L ABA或 150 mmol/L NaCl 处理的小麦幼苗中TaNOA基因转录本水平变化进行了分析(图5)。在ABA处理条件下，TaNOA的转录本水平在地上和地下部分组织中都有比较明显的上调。用150 mmol/L NaCl 处理10 h 后，其转录本略有升高。以上结果表明 TaNOA基因成员的转录本明显地受 ABA处理诱导，盐处理对其转录水平也有一定的上调作用。

表2 跨内含子-3或内含子-12 PCR片段的多态类型Table 2 Polymorphic types of the PCR fragments spanning introns-3 or introns-12

图3 普通小麦中TaNOA成员在不同的器官中的转录模式分析Fig.3 Transcriptional pattern analysis of TaNOA in different organs of common wheat(T.aestivum).Transcripts were amplified using gene specific primers, with the PCR products separated using 1% agarose gel.Equal loading was maintained for all samples.The amplification of wheat tubulin transcripts served as an internal control.R: root; S: stem; L: leaf; YS: young spike; SP: spikelet.

3 讨论

3.1 六倍体小麦基因组TaNOA成员数

小麦的基因组比较复杂，大约是水稻基因组的40倍，拟南芥基因组的100倍，基因组中有80%以上的重复序列[19-20]。对小麦基因组进行的大规模EST测序并对其中一些EST进行染色体定位，再通过与水稻、大麦、高梁以及短柄草等禾本科植物基因组的比较获得小麦基因组基因分布、排序的规律，加深了研究者对小麦基因组的了解，为开展小麦基因组的研究奠定了基础。由于目前尚无小麦全基因组序列信息，无法深入了解特定基因在基因组中分布和组成。本研究通过查询小麦EST数据库，获得与水稻、拟南芥NOA1相似性很高的的小麦EST序列(BF201083)，在此基础上通过分子生物学的手段获得TaNOA-B1 cDNA及其对应的基因组序列。比较TaNOA-B1和OsNOA(Os02g0104700)基因结构，设计两对保守的跨内含子的引物，通过基因组 PCR、克隆和测序后的序列多态性分析(表 2)，确定了小麦基因组中至少存在3个NOA成员，结合基于毛细管电泳的片段分析将这3个成员定位在6A、6B和6D染色体上(图2)。前人用BF201083做探针对六倍体小麦进行Southern杂交分析时发现3条杂交条带，分别定位于 6AS、6DS染色体上(http://wheat.pw.usda.gov/cgi-bin/westsql/map_locus.cgi?)。综合前人与本论文的实验结果，推测NOA在六倍体小麦中具有3个成员，分别定位于6A、6B和6D染色体上。

3.2 TaNOA-B1定位于线粒体

原生质体瞬时表达试验初步表明，TaNOA-B1-GFP融合蛋白的绿色荧光不与叶绿体的红色信号重叠，表明TaNOA-B1-GFP融合蛋白不定位在叶绿体中。从其荧光信号的分布，推测可能是在线粒体中，但确切的分布尚需要进一步的实验进行验证。TaNOA-B1的同源蛋白PtNOA定位在叶绿体中[10]。Guo等[21]的实验表明，AtNOA1-GFP融合蛋白定位于线粒体中。但 Flores-Pérez等[7]用 AtRIF-GFP转化Atnos1的等位突变体Atrif1，发现GFP荧光定位在叶绿体中。目前报道的NOA定位试验均是利用转基因技术进行的，将来需要寻找能检测野生型植物中NOA亚细胞定位的方法，以便确切地了解NOA发挥功能的部位。

图4 TaNOA-B1-GFP融合蛋白在拟南芥原生质体中的亚细胞定位Fig.4 Subcellular localization of TaNOA-B1-GFP fusion protein.(A)GFP signal detected in the protoplast.(B)Background autofluorescence of chloroplasts.(C)Bright-field image of the same protoplast shown in(A)and(B).(D)A merged image of(A)and(B)showing the different localization patterns of TaNOA-B1-GFP fusion protein and chloroplasts.Bar = 10 μm.

图5 在20 mmol/L ABA ABA和150 mmol/L NaCl分别处理4 h和10 h后TaNOA转录模式的分析Fig.5 Transcriptional pattern analysis of TaNOA genes in the wheat seedling treated with 20 mmol/ L ABA or 150 mmol /L NaCl after 4 h and 10 h.

3.3 TaNOA可能参与小麦对逆境的响应

在ABA处理条件下，植物内源的NO增加，促进气孔的关闭，而气孔的运动调节植物与外界的水分以及气体交换[22]，影响植物内部生理生化代谢。而在盐胁迫条件下，内源NO的变化，在不同的植物中有不同的结果。Zhao等[23]的研究结果表明，在盐胁迫条件，拟南芥内源的NO降低，NOS的活性下降。而Valderrama等[24]的研究表明，橄榄树叶片在盐胁迫条件下，NO和NOS的活性均上升。本实验中，在ABA和NaCl处理时，TaNOA的转录水平均上升，是否意味着小麦叶片中的NO含量上升，并进而通过NO参与小麦对逆境的响应，需要进一步的实验进行验证。

总之，本研究对普通小麦NOA成员的数目和染色体定位、表达模式以及其可能发挥的功能做了初步的探索，进一步的实验尚需对其他两个成员(TaNOA-A1和D1)进行克隆和研究，以便了解不同的成员是否在功能上有分化，相关实验正在进行中。

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Molecular cloning and preliminary analysis of TaNOA in common wheat

Lifang Hao1,2*, Chunmei Yu1,3*, Bin Li1,2, and Daowen Wang1
1 Institute of Genetics and Developmental Biology, Chinese Academy of Sciences, Beijing 100101, China 2 Graduate University of Chinese Academy of Sciences, Beijing 100049, China 3 School of Life Sciences, Nantong University, Nantong 226007, China

Received:September 22, 2009;Accepted:October 22, 2009

Supported by:National Basic Research Program of China(973 Program)(No.2009CB118300).

Corresponding author:Daowen Wang.Tel: +86-10-64889380; Fax: +86-10-64854467; E-mail: dwwang@genetics.ac.cn*These authors contributed equally to this study.国家重点基础研究发展计划项目(973计划)(No.2009CB118300)资助。