小鼠体内单核细胞增多性李氏杆菌的动态分布及病理变化

高磊，王静梅，蒋建军，剡根强，白晶

（石河子大学动物科技学院，石河子832003）

小鼠体内单核细胞增多性李氏杆菌的动态分布及病理变化

高磊，王静梅，蒋建军，剡根强，白晶

（石河子大学动物科技学院，石河子832003）

为进一步研究单核细胞增多性李氏杆菌的致病机制，培养浓度为9×109cfu／mL单核细胞增多性李氏杆菌，采用Karber法测得该菌对小鼠的LD50为2．85×108cfu／mL。由此建立小鼠模型，然后人工腹腔感染小鼠30只，分别在感染后2h、4h、6h、8h、10h、12h、24h、48h和72h定期剖杀感染小鼠，取其脏器，采用PCR方法、分离培养及病理组织学方法，对感染模型小鼠体内的单核细胞增多性李氏杆菌动态分布及各器官的病理组织学变化进行初步研究。结果显示：感染2h，脾、肝、心血组织中均可检测到单核增多性李氏杆菌DNA，同时从上述脏器也可分离到单核增多性李氏杆菌；感染6h，大脑中可检测到单核增多性李氏杆菌DNA，并在感染后72h可分离到该细菌；感染4～6h，脾、心血、肝脑即开始出现病理变化和组织学变化。

单核增多性李氏杆菌；小鼠；动态分布；病理变化

李氏杆菌是一种重要的食源性病原菌［1］，其中尤以单核细胞增多性李氏杆菌（Listeria monocytogene，LM）最为重要，该菌对人、家畜、家禽、野生动物均有侵袭力［2］。人畜感染后，主要表现为脑炎、败血症及流产［3］，因此，其在公共卫生方面有其特殊的重要性。最近的研究数据显示，美国因李氏杆菌病所造成医药费增加和生产率降低的比例逐年增加［4］。

近年来，有关LM对人及动物的致病机理已成为研究的热点。周霞等［5］以昆明系小鼠为实验动物模型，对致羔羊脑炎粪肠球菌进行半数致死量测定、临床症状观察、细菌学和病理学检查的研究，发现两种日龄小鼠均对致羔羊脑炎粪肠球菌株易感，最佳感染途径是腹腔注射，并从感染死亡小鼠部分实质器官中均分离出致羔羊脑炎粪肠球菌，小鼠感染粪肠球菌与羔羊自然感染症状及病变相似，验证了动物模型的成功建立；剡根强等［6］以健康的美利奴羊为实验动物模型，静脉注射LM，从临床症状、病理剖解及组织学角度验证了LM的致病机制。

本实验以昆明系小鼠为模型，通过腹腔感染LM，应用不同的方法探索LM在小鼠体内的动态分布规律和相应的病理学变化，以期为进一步研究LM的致病机制提供参考依据。

1 材料与方法

1．1 材料

致羔羊脑炎临床分离株S－90株由石河子大学人畜共患病实验室分离并保存；昆明系小鼠100只购于石河子大学试验动物中心；心脑浸液培养基购于北京路桥技术有限责任公司，生产批号：090803；主要试剂：Tag DNA聚合酶、MgCl2、10×PCR buffer、dNTP、10mg／mL蛋白酶K和Tris－HCl饱和酚（购于北京天庚生物工程公司）；伊红、苏木精－Fluka进口分装。伊红染液的配置方法按文献［7］中的方法进行。

1．2 方法

1．2．1 LM的培养

将LM接种于进口LB肉汤（含葡萄糖），于37℃培养箱培养18h，计数。测得LM的菌液浓度为9×109cfu／mL。

1．2．2 小鼠的LD50测定及模型建立

取36只临床健康、体重约20g昆明系小鼠，随机分为6组，试验组5组，每组6只，对照组6只。将菌液配制成9×109、9×108、9×107、9×106、9×105cfu／mL共5个稀释度，试验组以腹腔注射的方式对各组动物进行接种，接种量0．2mL／鼠；对照组腹腔注射灭菌生理盐水，注射量0．2mL／鼠。隔离饲养。并分别于接种后12h前每2h观察1次，观察7d，记录死亡情况，以Karber法计算。

1．2．3 LM在人工感染小鼠体内的分布检测

1．2．3．1 小鼠脏器中LM的分离鉴定 以获得的LD50为参数，获得的菌液1．2×108cfu／mL，人工感染小鼠30只，分别于2、4、6、8、10、12、24h至死亡每时间段平行取小鼠的脾、心血、肝、脑，在无菌情况下，取上述各组织分别接种至心脑浸液琼脂培养基，37℃培养24h，镜检观察及PCR检测。

1．2．3．2 建立PCR方法 分别于感染后2、4、6、8、10、12、24h取脾、肾、心血、肝、脑，采用已建立的LM PCR检测方法［8］，所用引物参照 Deneer等［9］设计的特异性引物（主要扩增保守的hlyA基因片段）。其扩增的片段长度为743bp。反应体系及扩增条件：10×Buffer（Mg2＋Free）2μL，DNA模板0．5μL，Taq酶 （5U／μL）0．5μL，dNTP（2．0 mmol）2．5μL，上下游引物（10μmmol／L）各0．5 μL，双蒸水补足20μL。扩增条件：94℃预变性变性5min；94℃60s，57℃60s，72℃60s，30个循环；最后72℃延伸5min，于4℃结束反应。于1%琼脂糖凝胶在0．5×TBE电泳缓冲液中进行电泳，以出现743bp特异性条带为阳性，不出现任何条带则为阴性。

1．2．3．3 组织病理学观察 分别于感染后2、4、6、8、10、12、24、48h取脾、肾、心血、脑、肝放入10%的福尔马林溶液中，固定24h。经过水洗、脱水、透明、浸蜡、包埋、切片、H－E染色、封片。镜检观察。

2 结果

2．1 临床症状

36只接种小鼠中，食欲普遍降低，精神沉郁，共发病死亡12只，其中5只在接种后30～40h抽搐，角弓反张，很快死亡；7只于接种后3～5d发病死亡，死前1～3h出现抽搐、转圈等神经症状。接种后未死亡的小鼠，7d后精神、食欲等逐渐恢复正常。其中有2只感染小鼠出现原地转圈等典型的神经症状，但未死亡。

2．2 小鼠的LD50测定结果

通过Karber的计算方法得知，经过试验得知致绵羊脑炎单核增多性李氏杆菌的LD50为2．85×108cfu／mL。

2．3 LM在人工感染小鼠体内的分布结果

2．3．1 LM分离结果

感染后2、4、6、8、10、12、24、48、72h均可从脾脏、肾脏、心血、肝脏中分离出LM，而脑中未分离出LM。直到72h时才从脑组织中分离到LM。结果见表1。

表1 感染的小鼠组织器官中李氏杆菌的分离情况Tab．1Results of detection tissues of mouses acutly infected with Listeriamonocytogenes

2．3．2 细菌PCR检测结果

PCR检测结果见表2和图1。

表2 感染的小鼠组织器官中分布的细菌PCR检测结果Tab．2Results of detection tissues of mouses acutlyinfected with Listeria monocytogenes by PCR

由表2和图1可知：感染2h时，从肝脏、脾脏、肾脏、心血中检测到LM的DNA，而脑中未检测到；感染6h时，从各个组织中检测到该菌的DNA。

图1 小鼠感染6h后组织脏器LM DNA PCR扩增结果Fig．1The rusult of Listeria monocytogenes with PCR in5tissues of mouse infected after 6h

2．3．3 病理剖解变化

2h和4h时，肝脏和脑无明显的病理变化，脾脏稍有水肿；6h时，大部分小鼠的脾脏明显肿大，发生水肿，肾脏肿大，脑部未见明显的病理变化。肝脏肿大，紫红色，质脆。

2．3．4 病理组织学变化

部分脏器病理变化见图2。

图2 小鼠部分脏器的病理变化Fig．2Pathological changes of partial organs on mouse

在感染4h和6h时，脾脏红髓、白髓的界限不清，白髓的淋巴滤泡不明显，淋巴细胞数量减少，红髓部分的红细胞数量减少；脑膜稍增厚，脑膜下面的毛细血管高度扩张，脑膜下有数量不等的单核细胞，脑神经元（细胞）水肿比较明显，脑神经细胞有坏死。在脑实质部分有坏死灶，局部坏死灶区域的细胞核溶解，可见有单核细胞，坏死灶的表现为灰白色的点状的坏死，部分脑毛细血管表现有微血栓形成；大多数心肌细胞发生变性（以颗粒变性为主）及坏死（许多心肌细胞核溶解消失，成一片均质的红染），部分心肌肌纤维断裂。肝脏的肝小叶尚存，结构较清晰，高倍镜下，有的肝细胞表面有颗粒变性，有许多肝细胞表现为脂肪变性，在很多肝细胞胞浆里，表现为大小不等的空泡。

8h后逐渐表现出了典型的病理变化，脾脏的吞噬细胞明显增多，体积增大，细胞核不规则，有的脾小梁坏死，红髓部分的淋巴细胞增多；心肌中心肌纤维实质的小动脉、毛细血管、小静脉高度扩张、淤血、充血；肝脏的肝小叶消失，许多肝细胞体积增大，表现大小不等的空泡；肾脏肾小球体积增大，表现富核现象，肾小球囊狭小部分肾球囊内有丝状的纤维蛋白，肾小管上皮细胞肿大，胞浆内有少量淡红色微细的蛋白颗粒，有的上皮细胞膜破裂，少量蛋白颗粒流失于管腔中，使之狭窄，不规则，呈现星芒状。

3 讨论

3．1 LM在小鼠体内的动态分布规律

在感染2h时，通过分离培养，在脾脏、肾脏、心血、肝脏均可得到该菌。本实验通过建立的PCR快速检测方法，在6h时，可在所有检测脏器即脾脏、肾脏、肝脏、心血、脑中检测到LM的DNA。由此可以看出，这二种方法结合，能更好的验证LM在动物体内分布情况的准确性，大大增加了试验的可靠性。同时在4h时，剖解的小鼠各个脏器无明显的病理变化，只是脾脏稍有肿大，而在6h时，脾脏、肝脏等发生明显的病理变化，脾脏肿大，肝脏明显水肿，紫红色，这说明随着时间的增加，LM在小鼠体内不断的增殖，侵袭各个脏器，造成各个脏器功能性障碍。细菌分离和PCR检测结果显示，脾脏、肝脏、心血的检测在最早的时间内出现阳性结果，说明LM更易侵入上述脏器，这是快速检测李氏杆菌病的最佳取材部位，而大脑6h时才检测到LM的DNA，72h才从大脑分离到该菌，并在感染早期脑组织病理变化不明显，这可能与血脑屏障免疫机制有关系，至于分离株进入血液循环如何突破血脑屏障最终定居在脑部导致LM脑膜脑炎发生的机理还需更进一步研究。

病原体在动物体内的动态分布规律是传染病学的一个重要的组成部分，对于研究动物的发病机理，诊断以及流行病学调查有着重要的意义，同时也提供了理论依据［5］。

3．2 LM感染小鼠后引起各组织的病理性变化和组织学变化

在LM感染4h，各个脏器没有呈现明显的病理变化，脾脏稍有肿大。6h时，各个脏器都呈现了不同的病理性变化，肿大脾脏明显。脑部水肿。肝脏肿大，紫红色，质脆。造成这样的病理变化是因为该菌能侵袭肠黏膜上皮细胞及肝、脾巨噬细胞，成为胞内寄生菌，而另一途径则是通过损伤的黏膜经神经末梢的鞘膜进犯中枢神经系统。相应的组织学变化也论证了上述病理性变化，即从6h就可看到脾小梁坏死，脑膜稍增厚，脑膜下面的毛细血管高度扩张，脑膜下有数量不等的单核细胞，脑神经元水肿比较明显，脑神经细胞有坏死，心肌纤维实质的小动脉、毛细血管、小静脉高度扩张，淤血、充血，部分心肌肌纤维断裂等等，主要器官的剖检和病理组织学变化与文献［6］报道的LM病理特征基本吻合。由此可以看出，在小鼠感染初期，LM引发炎症，血管充血，继而损害了血管壁的通透性，并在这一时期各组织器官的切片可以见到明显的淤血、充血，而心血管系统的损伤又造成全身性的器官损伤，引起肝脏、脾脏、肾脏的变性坏死。

3．3 小鼠模型的建立

国内学者曾用LM成功感染了绵羊、山羊、兔子，建立了动物模型。剡根强等［6］利用LM感染健康的美利奴绵羊，成功的从脑、心血、淋巴结回收到了该菌，但是以绵羊作为模型，经常会受到品种、年龄、个体差异及需进行免疫抑制剂处理等因素限制。殷月兰等［10］用基因双缺失的单核细胞李氏杆菌，以小鼠为模型进行感染动力学研究，发现小白鼠模型能适应研究不同毒株间的协同致病机制。本实验通过人工感染小鼠，建立了动物模型，可重复性好。通过腹腔接种，小鼠均可以产生脑炎，并且能从脑组织中分离到接种菌。接种后的小鼠出现精神沉郁、运动失调等神经症状，死亡小鼠各实质器官充血并发生炎症，出现脑组织不同程度的水肿和坏死，与绵羊自然感染病例的剖解变化相同。该分离菌株对小鼠的LD50为2．85×108cfu／mL，相对其它病原菌的LD50要小，可能是因为LM的溶血素与毒力基因簇发生协同作用。周霞等［5］用致羔羊脑炎肠球菌感染小鼠，成功的建立了小鼠模型，并从传统的细菌分离鉴定、免疫组化法、PCR方法三方面很好地探索肠球菌的感染机制。本实验在其成功基础上采用分离鉴定和PCR方法，研究LM在小鼠体内的分布及病理变化，初步掌握了LM的致病机制。

4 结论

用致绵羊脑炎单核细胞增多性李氏杆菌分离株感染小鼠，测得该菌的LD50为2．85×108cfu／mL；定期剖杀腹腔接种LM的小白鼠，感染2h，用PCR方法即从脾、肝、心血、肾组织中检测到该菌的DNA，并从上述脏器中分离到该细菌，感染6h后，从脑组织中检测到该菌的DNA，并在72h时在脑组织中分离到该细菌；感染6h后各个脏器出现明显的病理变化，由于致绵羊脑炎的李氏杆菌在人工感染小鼠体内分布广泛，引起病理变化是全身性的。因此，本研究成功的建立了动物模型。

［1］Esteban J I，Oporto B，Aduriz G，et al．Faecal shedding and strain diversity of Listeria monocytogenes in healthy ruminants and swine in Northern Spain［J］．BMC Vet Res，2009，5：2．

［2］陆承平．兽医微生物学［M］．北京：中国农业出版社，2001．

［3］王志祥，王静梅，王耀峰．单核增多性李氏杆菌多克隆抗体的制备及纯化［J］．石河子大学学报：自然科学版，2003，7（1）：4－6．

［4］Birth，Lasse，Bente．Diversity of Listeria monocytogenes isolates from cold－smoked salmon produced in different smokehouses as assessed by random amplified polymorphic DNA analyses［J］．Inter Food Microbiol，2001，65：83－92．

［5］周霞，剡根强，马勋，等．致羔羊脑炎粪肠球菌人工感染小鼠模型的建立［J］．西北农业学报，2007，16（5）：15－17，21．

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［7］盛彩霞，周萍．介绍一种改良伊红染液的配置法［J］．诊断病理学杂志，2006，13（2）：160．

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Distribution and Pathological Changes in Artificial Infectious Mice Model for Listeria monocytogenes

GAO Lei，WANG Jingmei，JIANG Jianjun，YAN Genqiang，BAI Jing
（Animal Science and Technology College，Shihezi University，Shihezi 832003，China）

In order to find out pathogenic mechanism for Listeria monocytogenes，cultivating Listeria monocytogenes whose concentration is 9×1010cfu／mL，LD50of the bacteria is 2．85×108cfu／mL caculated with Karber．27mices infected through abdominal by Listeria monocytogenes are killed at 2h，4h，6h，8h，10h，12h，24h，48h，72h．Distribution of Listeria monocytogenes and pathological changes in different argans are studied in artificial infectious mice by PCR，cultivation and pathohistoloy．Listeria monocytogenes and its DNA can be detected in spleen，liver，kidney，cardiac muscle at 2hafter artificial infectious mouse and ListeriamonocytogenesDNA can be detected in encephalon at 6h，Listeria monocytogenes can be detected in the tissues at 72h．Significant histopathological changes are observed during 4～6hin spleen，kidney，cardiac muscle，liver，encephalon．

Listeria monocytogenes；mouse；distribution；pathological change

S858．9

A

2009－11－02

教育部春晖计划项目（500003120702）

高磊（1983－），男，硕士生，专业方向为动物传染病诊断与防治；e－mail：w．n007＠163．com。

剡根强（1958－），男，教授，博士生导师，从事动物传染病的诊断与防治研究；e－mail：ygq58＠shzu．edu．cn。