绵羊MHC区段BAC克隆探针的制备

邹毅辉，李鑫，李峰，薛峰，陈芳，高剑峰

（石河子大学生命科学学院，石河子832003）

绵羊MHC区段BAC克隆探针的制备

邹毅辉，李鑫，李峰，薛峰，陈芳，高剑峰

（石河子大学生命科学学院，石河子832003）

为了摸索适用于高通量核酸杂交筛选的探针的制备方法，采用GeneQuest软件分析并选取限制性内切酶BseDⅠ酶切 MHC区段BAC克隆374N21，对酶切产物32P末端标记，并采用 Omega E．Z．N．A DNA Probe Purification Kit纯化后放射自显影检测的方法。结果显示：酶切结果与软件分析一致，纯化后探针分布为0．5～2．0kb，纯化回收效率为60%。探针的分布合理，质量较高，可满足高通量杂交筛选的需要。

32P标记；绵羊；MHC；放射性自显影；DNA探针

主要组织相容性复合体（major histocompatibility complex，MHC）是被广泛研究的1个基因组区域。MHC的主要作用有：MHC以特殊的方式参与移植反应；MHC基因的产物广泛参与所有哺乳动物的免疫反应的遗传控制。目前国内外关于MHC的遗传组成，结构与功能的研究已经进行了大量的工作，并取得了很大的进展，但绵羊MHC基因的组成及功能研究报道较少。我国是绵羊资源品种丰富的国家，拥有很多特有的地方品种资源，因此开展我国绵羊的MHC研究，发现一些抗病基因，在我国的绵羊抗病育种等领域具有重要的作用。

詹勇华等［1］利用细菌人工染色体的载体pCC1BAC构建了中国美利奴细毛羊的基因组BAC文库，克隆总数约19万个，非重组率为3．2%，平均插入片段大小约为133kb，约7．8倍基因组覆盖率。并绘制出第一张最详细的反刍动物MHC区域的物理图谱。连续多次传代培养文库实验证实文库克隆的遗传稳定性好［1］，为研究和筛选绵羊 MHC区段基因提供了良好的平台［2］。

噬菌体原位杂交的方法可以成功的从大片段基因组DNA中分离和鉴定出编码序列，这种方法工作量大，但是较为简便和实用，1次可对数百个kb基因组DNA区域内的表达序列进行筛选［3］。高质量的探针制备是杂交筛选成功的最重要的前提条件。本研究通过对32P标记绵羊MHC区段BAC克隆探针制备方法的研究，旨在为快速，准确筛选绵羊MHC区段基因奠定基础。

1 材料与方法

1．1 材料

中国美利奴细毛羊BAC文库MHC区段374N21（编号表示该克隆位于第374号文库保存平板第N行第21列）BAC克隆。

BseD I限制性内切酶订购自Fermentas公司，Omega E．Z．N．A DNA Probe Purification Kit，10 μCi／μL32P订购自北京福瑞公司。

1．2 方法

1．2．1 GeneQuest软件分析374N21BAC克隆酶切位点

利用GeneQuest软件分析374N21BAC克隆，选择酶切后片段分布在2．5kb以下的限制性内切酶BseDⅠ。

1．2．2 374N21BAC克隆质粒的提取

从－80℃冰箱取出BAC文库，在超净工作台中用接种环沾取374N21BAC克隆菌液，在平板上划线。37℃恒温培养箱中培养过夜，挑取单菌落到含12．5μg／mL氯霉素液体培养基，37 ℃，180r／min过夜培养8～12h，采用碱裂解法提取374N21 BAC克隆质粒［4］。

1．2．3 绵羊 MHC class I区段374N21BAC克隆质粒的酶切

在55℃反应条件下用BseDI酶切374N21 BAC克隆质粒4h。取酶切产物10μL琼脂糖电泳检测。

1．2．432P末端标记法标记探针

取酶切产物4μL，加入10×Buffer 4．0μL，3×dNTPs（dATP，dGTP，dTTP 2mol／L each）5．0μL，Klenow Fragment（10U／μL）0．2μL，ddH2O 22．8 μL，［a－32P］－dCTP（10μCi／μL）4．0μL。30℃反应30 min。70℃加热5min，终止反应，取10μL用1．5%琼脂糖凝胶电泳。另取1．0μL进行盘分析定量。

1．2．5 探针纯化及电泳放射性自显影检测

取20μL的探针反应体系，用 Omega E．Z．N．A DNA Probe Purification Kit纯化，60μL ddH2O洗脱，取10μL，用1．0%琼脂糖凝胶电泳后放射自显影鉴定探针标记及洗脱情况。另取1．0μL进行盘分析定量。

2 结果与分析

2．1 374N21BAC克隆酶切结果

限制性内切酶BseDⅠ酶切结果显示与GeneQuest软件分析结果一致（图1、图2）。酶切后的片段分布在2kbp以下。

图1 374N21隆GeneQuest软件酶切Fig．1Plasmid DNA digestion by GeneQuest software

图2 374N21克隆BseDI酶切电泳Fig．2Plasmid DNA digestion by BseDI

2．2 探针纯化结果

探针经Omega E．Z．N．A DNA Probe Purification Kit纯化后凝胶电泳和放射性自显影结果（图3）显示探针分布在0．5～2．0kb。其纯化效果明显，有效的去除小片段核酸，且放射性强度能够满足杂交后进行自显影以便对目的片段进行定位的要求。

2．3 探针的定量

洗脱前探针浓度为0．1μg／μL，20μL的体系总的探针含量为2．0μg，纯化后探针浓度为0．02 μg／μL，纯化后探针总量为1．2μg，回收效率为60%（图4）。

图3 探针纯化结果Fig．3The probes of purification

图4 探针盘分析定量Fig．4Quantitative probes by plate assay

3 讨论

动物的MHC对了解动物发病、育种等方面具有很高的价值。对人［5］、老鼠［6］、鸡［7］、牛［8］和羊［9］的研究表明了MHC与疾病的抗性、易感性和发病过程是相联系的。目前，国内外关于MHC的遗传组成，结构与功能的研究已经进行了大量的工作，并取得了很大的进展，但绵羊MHC研究较少，且多数集中在基因多态性的研究［10］。我国的绵羊品种资源丰富，拥有很多特有的地方品种资源，因此开展我国绵羊的MHC研究，发现一些抗病基因，在我国的绵羊抗病育种等领域具有重要的作用。

据文献［11］报道，放射性探针的制备包括末端标记，缺口平移及随机引物等多种方法，而本研究所采用的大片段DNA酶切及末端标记杂交探针的方案。与其他方案相比本方案具有易于操作跟踪和检测等优点，是一种有效筛选特定区域基因的方法，但是这种方案对探针的质量要求较高。本研究通过GeneQuest软件分析选择合适的限制性内切酶，酶切减小杂交探针的长度，去除小片段核酸的干扰，准确的定量探针的浓度，制备得到的探针纯化后片段大小与预期值相近且分布合理，探针浓度及放射性标记强度均处于可接受范围内。可初步判断利用本研究中方法制备的探针符合进一步研究的要求。目前利用这些探针进行的核酸杂交工作正在进行中。

［1］詹勇华，陈创夫，高剑峰，等．中国美利奴细毛羊BAC文库的质量评价［J］．石河子大学学报：自然科学版，2006，24（1）：102－104．

［2］Liu H，Liu K，Wang J，et al．A BAC clone－based physical map of ovine major histocompatibility complex［J］．Genomics．2006，88（1）：88－95．

［3］韩力薇，覃文新，赵新泰，等．以PAC和BAC克隆为探针筛选cDNA 文库［J］．上海医科大学学报，2000，27（6）：449－452．

［4］萨姆布鲁克J．分子克隆实验指南［M］．黄培堂．北京：科学出版社，2002．

［5］Thomson G．HLA disease associations：models for the study of complex human genetic disorders［J］．Crit Rev Clin Lab Sci，1995，32（2）：183－219．

［6］Walter L，Hurt P，Himmelbauer H，et al．Physical mapping of the major histocompatibility complex class II and class III regions of the rat［J］．Immunogenetics，2002，54（4）：268－275．

［7］Kaufman J，Milne S，Gobel T W，et al．The chicken B locus is a minimal essential major histocompatibility complex［J］．Nature，1999，401（6756）：923－925．

［8］Ballingall K T，Ellis S A，Machugh N D，et al．The DY genes of the cattle MHC：expression and comparative analysis of an unusual class II MHC gene pair［J］．Immunogenetics，2004，55（11）：748－755．

［9］贾斌，申红，余智勇，等．多浪羊和中国美利奴羊 MHCDRB＿1基因多态性与包虫病的遗传易感性［J］．中国人兽共患病学报，2007，23（10）：1004－1005．

［10］彭林泽，袁其彬，郭玉强，等．多浪羊 MHC－DRB1基因的HaeⅢ酶切多态性［J］．石河子大学学报：自然科学版，2007，25（2）：177－179．

［11］Elvin P，Slynn G，Black D，et al．Isolation of cDNA clones using yeast artificial chromosome probes［J］．Nucleic Acids Res，1990，18（13）：3913－3917．

Preparation of Probes Using the MHC Section BAC Cloning of Sheep

ZOU Yihui，LI Xin，Lifeng，XUE Feng，CHEN Fang，GAO Jianfeng
（College of Life Science，Shihezi University，Shihezi 832003，China）

In Order to find a way to manufacture probes that could meet the demand of high throughput hybrid screening，restriction enzymes of BseDⅠdigested the 374N21clone of BAC MHC was analysed by using the Gene Quest software．The production of the digestion labeled with32P，Autoradiography detection after being purified by Omega EZNA DNA Probe Purification Kit．The results showed that digestion results were consistent with the software analysis．Purified probes distribution in 0．5～2．0kb．The efficiency of the purification recovery was 60%．The higher quality of probes can satisfy the needs of hybrid screening．

label with32P；sheep；MHC；probe

S826；Q78

A

2009－06－24

国家科技部国际合作重大项目（2006DFB33750）

邹毅辉（1983－），男，硕士，专业方向为动物免疫与育种；e－mail：zyh2319731＠163．com。

高剑峰（1964－），男，教授，博士生导师，从事动物免疫与育种研究；e－mail：jianfengg＠shzu．edu．cn。