利用荧光定量PCR检测B．ovis侵染巨噬细胞RAW264．7的相对数量

葛阳春，王远志，陈创夫，杜军伟

（1石河子大学动物科技学院，石河子832003；2新疆民族与地方高发病教育部重点实验室，石河子832003）

利用荧光定量PCR检测B．ovis侵染巨噬细胞RAW264．7的相对数量

葛阳春1，2，王远志2，陈创夫1，杜军伟1，2

（1石河子大学动物科技学院，石河子832003；2新疆民族与地方高发病教育部重点实验室，石河子832003）

为了探讨布鲁氏菌胞内寄生的机制，采用荧光定量PCR方法对进入巨噬细胞的布鲁氏菌的数量进行检测，克隆了绵羊种布鲁氏菌019株的16SrRNA基因和小鼠巨噬细胞RAW264．7的GAPDH基因。以16SrRNA基因和巨噬细胞GAPDH做为内参基因，将二者的比值作为检测布鲁氏菌进入巨噬细胞数量多少的指标，建立绵羊种布鲁氏菌019株侵染巨噬细胞不同阶段的感染模式。结果表明：在绵羊种布鲁氏菌019株侵染巨噬细胞15min～1h，16SrRNA与GAPDH的比值缓慢上升，侵染1～4h中，16SrRNA与GAPDH的比值急剧上升，说明在此阶段，细菌侵入细胞中的数量显著增多。

绵羊种布鲁氏菌019株；巨噬细胞RAW264．7；荧光定量PCR

布鲁氏菌病（Brucellosis）是由布鲁氏菌（Brucella）侵入机体后引起的变态反应性人畜共患传染病［1－2］。该病广泛分布于世界各地，在许多国家都有不同程度的流行。人的感染此病主要来自染疫的家畜，病期可长达数月、数年，甚至几十年，严重时可致残，丧失劳动能力［3］。家畜患布病后出现流产、死胎、不孕、乳腺炎和睾丸炎等，可造成巨大经济损失［4］，严重影响着畜牧业发展［5］。流行病学调查显示，绵羊种布鲁氏菌是严重危害新疆畜牧业发展和农牧民健康的病原之一［6］。

布鲁氏菌是兼性胞内寄生菌，主要定居在巨噬细胞和胎盘滋养层细胞这两类宿主细胞。在感染早期，吞噬泡中绝大多数布鲁氏菌被巨噬细胞杀死［7－8］。随后存有少量活菌的吞噬泡与内质网持续相互作用，进一步转变为复制小体或布氏小体，此时存活的布鲁氏菌能够抵抗巨噬细胞的再次攻击，进而在巨噬细胞中快速繁殖，此外，布鲁氏菌的某些蛋白可抑制巨噬细胞的凋亡［7］，可避免巨噬细胞死亡崩解后，使布鲁氏菌再次面对机体免疫和细胞免疫的不利环境，从而保护布鲁氏菌在巨噬细胞内的长期生存，成为布病慢性感染的重要原因之一。

本试验以绵羊种布鲁氏菌019株16SrRNA基因和巨噬细胞GAPDH基因为内参，建立019株侵染巨噬细胞感染模型，在感染15min、30min、1h、4 h后，用荧光定量PCR检测胞内菌16SrRNA与侵染细胞GAPDH相对数量，进而分析在感染不同阶段布鲁氏菌胞内寄生数量的变化，为进一步研究布鲁氏菌的入侵模式和胞内定位奠定基础。

1 材料与方法

1．1 材料

1．1．1 细胞和菌株

细胞：小鼠巨噬细胞RAW264．7细胞株购自中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库；菌株：绵羊种布鲁氏菌019株和大肠杆菌DH5a由本实验室保存。

1．1．2 主要试剂

DMEM干粉和小牛血清为GIBCO产品，质粒小提试剂盒、DNA胶回收试剂盒、T4DNA连接酶、pGM－T、DNA Marker购自天根生物技术有限公司，荧光定量PCR试剂盒购自晶芯生物有限公司，布鲁氏菌固体和液体培养基购自美国BD公司，Trizol购自Invitrogen公司，反转录试剂盒购自大连TaKaRa公司，其他试剂为国产分析纯产品。

1．2 方法

1．2．1 16SrRNA基因和GAPDH基因实时定量引物的设计

根据Primer－3在线生物软件针对绵羊种布鲁氏菌019株16SrRNA基因和小鼠巨噬细胞GAPDH基因设计实时定量PCR引物，扩增长度分别为159bp和163bp，由上海生工生物工程技术服务有限公司合成，浓度10D／管，引物序列见表1。

表1 实时定量PCR引物设计Tab．1Primer sequences for real－time PCR

1．2．2 16SrRNA基因和GAPDH基因的克隆

1．2．2．1 细菌16SrRNA基因的克隆

收集绵羊种布鲁氏菌019株，以85℃灭活30 min的该菌株为模板扩增16SrRNA基因。取灭活的019株菌液1μL，10×PCR buffer 2μL，2．5 mmol／L dNTP 0．8μL，引物 P1（25μmol／L）、P2（25μmol／L）各0．4μL，双蒸水14．3μL，Taq plus DNA聚合酶0．3μL（5U／μL）混匀。PCR反应条件为95℃预变性4min，95℃50s，64℃50s，72℃50s，30个循环，72℃延伸10min。经1%琼脂糖凝胶电泳检测，将PCR阳性条带回收，连于克隆载体pGM－T后送上海生工生物工程技术服务有限公司进行测序。

1．2．2．2 细胞GAPDH 基因的克隆

用Trizol试剂盒提取小鼠巨噬细胞总RNA，并用反转录试剂盒进行反转录。取反转录产物1μL，10×PCR buffer 2．0μL，2．5mmol／L dNTP 0．8 μL，引物P3（25μmol／L）、P4（25μmol／L）各0．4 μL，双蒸水14．3μL，Taq plus DNA聚合酶0．3μL（5．0U／μL）混匀。

PCR反应条件：94℃预变性4min，94℃50s，58℃50s，72℃30s，30个循环，72℃延伸10 min。经1%琼脂糖凝胶电泳检测将PCR阳性条带回收，连于克隆载体pGM－T后送上海生工生物工程技术服务有限公司进行测序。

1．2．3 16SrRNA和GAPDH基因荧光定量标准曲线的制作

将测序正确的阳性克隆重新摇菌后提取质粒，建立10－2～10－8的6个拷贝数的100倍梯度稀释，绘制标准曲线。

1．2．4 绵羊种布鲁氏菌019株侵染RAW264．7巨噬细胞试验

1．2．4．1 绵羊种布鲁氏菌019株的计数

将绵羊种布鲁氏菌019株保存的冻干菌接种于布鲁氏菌琼脂培养基上，置于CO2培养箱，37℃，10%CO2培养4d，挑取单菌落，接种于布鲁氏菌斜面培养基上再培养3d，加入2mL生理盐水，用接种针轻轻将斜面培养基上的细菌刮下，以10－1、10－2、10－3、10－4、10－5、10－6、10－7、10－8、10－9、10－10、10－11、10－12、10－13、10－14、10－15均匀稀释 细菌，并取200μL 10－12、10－13、10－14、10－15稀释菌液涂布于120mm含有10%小牛血清肝琼脂培养基的平板中，每一稀释度涂2个平板，置于10%CO2、37℃的CO2培养箱中培养4d。

1．2．4．2 绵羊种布鲁氏菌019株在不同的时间段侵染RAW264．7巨噬细胞

小鼠巨噬细胞RAW264．7用含10%DMEM培养液培养（加青霉素、链霉素），在细胞长到对数生长期时将RAW264．7置于6孔细胞培养板中，培养条件为37℃、5%CO2。

培养48h后，用不含抗生素的细胞培养液换液，计数细胞个数，用新鲜培养的绵羊种布鲁氏菌019株按细菌：细胞50∶1的比例进行侵染，并将侵染的小鼠巨噬细胞继续置于5%CO2、37℃的CO2培养箱中培养，培养15min、30min、1h、4h后弃去培养基，用PBS洗涤细胞3次，将留在胞外的细菌洗掉，收集侵染细胞，提取总RNA后，反转录成cDNA，以cDNA为模板，以建立的1．2．3中的方法进行细菌16SrRNA和细胞GAPDH基因的荧光定量的检测。

2 结果

2．1 布鲁氏菌16SrRNA基因PCR扩增结果

用引物P1和P2对绵羊种布鲁氏菌019株进行扩增检测，可得到159bp的核酸片段（图1）。

图1 16SrRNA基因的扩增Fig．1PCR amplification of 16SrRNA

2．2 巨噬细胞GAPDH基因PCR扩增结果

用Trizol提取小鼠巨噬细胞总RNA，经电泳检测条带明亮清晰，无降解现象。用引物P3和P4对cDNA进行扩增检测，可得到163bp的核酸片段，与预期的一致（图2）。

图2 GAPDH基因的扩增Fig．2PCR amplification of GAPDH

2．3 布鲁氏菌16SrRNA基因标准曲线的制作

16SrRNA基因的标准曲线方程为：

上式中，相关系数为0．997，基因的扩增效率为69，扩增产物的溶解曲线Tm值为86．3～87．2（图3）。

图3 16SrRNA标准曲线、溶解曲线Fig．3Standard curve and melting curve of 16SrRNA gene

2．4 巨噬细胞GAPDH基因标准曲线的制作

GAPDH基因的标准曲线方程为：上式中，相关系数为0．996，基因的扩增效率为66，扩增产物的溶解曲线只有1个峰值，Tm值为87．6（图4）。

图4 GAPDH标准曲线、溶解曲线Fig．4Standard curve and melting curve of GAPDH gene

2．5 绵羊种布鲁氏菌019株侵染RAW264．7细胞cDNA的检测结果

绵羊种布鲁氏菌019株在15min、30min、1h、4h时间段分别侵染转染了巨噬细胞RAW264．7后，收集被不同时间段侵染的细胞，提取细胞总的RNA，反转录后以GAPDH的引物进行常规PCR对cDNA的检测，结果见图5。

图5 GAPDH基因的扩增Fig．5PCR amplification of GAPDH

2．6 绵羊种布鲁氏菌019株侵染RAW264．7细胞荧光定量的检测结果

检测结果见图6。

图6 绵羊种布鲁氏菌019株在侵染过程中的相对表达量Fig．6Expression of Brucella ovis 019strain during the infection

用布鲁氏菌16SrRNA的数量／巨噬细胞GAPDH的数量的比值作为检测指标进行比较，结果（图6）表明在绵羊种布鲁氏菌019株侵染巨噬细胞15min～1h，16SrRNA与GAPDH的比值缓慢上升，在侵染1h～4h，16SrRNA与GAPDH的比值急剧上升，说明在此阶段，细菌进入细胞中的数量显著增多。

3 结论

布鲁氏菌病是由布鲁氏菌属的细菌引起的人畜共患传染病［9］。布鲁氏菌感染滋养层细胞，使胎儿胎盘与母体胎盘分离，从而导致流产［10］；布鲁氏菌感染巨噬细胞，并在巨噬细胞内生存、繁殖，从而引起布鲁氏菌病的慢性感染和反复发作［5］。布鲁氏菌感染宿主细胞需经过四步：黏附、侵入、定植和传播［11］。布鲁氏菌胞内寄生数量与其感染阶段有关。当前菌落形成单位（CFU）是胞内布鲁氏菌计数方法的“金标准”［12］。该方法是建立在布鲁氏菌培养的基础上，操作危险、复杂、耗时。随着现代生物学技术的发展，荧光定量PCR［13］以其独特的优点被广大研究者青睐。

本研究结合荧光定量PCR实时动态连续监测、灵敏度高等特点，分别以布鲁氏菌丰度保守的16S rRNA和巨噬细胞表达恒定的GAPDH基因为研究对象，通过荧光定量PCR的方法绘制了2个基因的标准曲线，并在绵羊种布鲁氏菌019株侵染巨噬细胞的15min、30min、1h、4h时收集细胞，将细菌16SrRNA基因和细胞GAPDH基因二者的比值作为检测指标进行侵染前后的比较，结果表明，在感染阶段属于黏附期，16SrRNA与GAPDH的比值缓慢上升；在感染阶段属于侵入期，16SrRNA与GAPDH的比值急剧上升，该结论与 Watarai等［14］的报道一致。本研究后期用CFU验证荧光定量PCR的结果，在布鲁氏菌感染的1～4h，胞内布鲁氏菌数量较15～30min的数量明显增多，这间接说明了荧光定量PCR结果的准确性。

［1］张红星，陈创夫，王远志，等．羊种布鲁氏菌 M5－90 OMP31蛋白原核表达［J］．石河子大学学报：自然科学版版，2009，27（5）：593－596．

［2］刘辉，陈创夫，许程建，等．新疆绵羊种布鲁氏菌Gro EL基因的克隆及序列分析［J］．石河子大学学报：自然科学版版，2005，23（6）：683－686．

［3］Claire E Dawson，Emma J Stubberfield，Lorraine L Perrett．Phenotypic and molecular characterisation of Brucella isolates from marine mammals［J］．BMC Microbiology，2008，8：224．

［4］唐利燕，陈创夫，王远志，等．布鲁氏菌bp26基因的原核表达及BP26－间接ELISA方法的初步建立［J］．石河子大学学报：自然科学版，2009，27（4）：437－440．

［5］Pappas G，Papadimitriou P，Akritidis N，et al．The new global map of human brucellosis［J］．Lancet Infect Dis，2006，6（9）：538－541．

［6］王茂武，宫新生，尚德秋．市场经济下布鲁氏菌病防治工作的新思路［J］．疾病监测，2004，19（8）：306－308．

［7］He Y，Reichow S，Ramamoorthy S，et al．Brucella melitensis triggers time－dependent modulation of apoptosis and downregulation of mitochondrion－associated gene expression in mouse macrophages［J］．Infect Immun，2006，74（9）：5035－5046．

［8］Jimenez de Bagues，Maria Pilar，Sherri Dudal，et al．Cellular bioterrorism：how Brucella corrupts macrophage physiology to promote invasion and proliferation［J］．Clin Immun，2005，114：227－238．

［9］Young E J．An overview of human brucellosis［J］．Clin Infect Dis，1995，21：283－289．

［10］Suk Kim，Dong Soo Lee，Kenta Watanabe，et al．Interferonγpromotes abortion due to Brucella infection in pregnant mice［J］．BMC Microbiology，2005，5（22）：1471－1481．

［11］Elias Barquero Calvo，Esteban Chaves Olarte1，David S Weiss，et al．Brucella abortus uses a stealthy strategy to avoid activation of the innate immune system during the onset of infection［J］．PLoS ONE，2007，7：1－14．

［12］Pascaline Fontes，Maria Teresa Alvarez Martinez，Antoine Gross，et al．Absence of evidence for the participation of the macrophage cellular prion protein in infection with Brucella suis［J］．Infec and Immun，2005，73（10）：6229－6236．

［13］张驰宇，成婧，李全双，等．荧光实时定量PCR的研究进展［J］．江苏大学学报：医学版，2006，16（3）：268－270．

［14］Watarai M，Makino S，Fujii Y，et al．Modulation of Brucella－induced macropinocytosis by lipid rafts mediates intracellular replication［J］．Cell Microbiol，2002，4（6）：341－355．

Detection of Comparative Quantity of Brucella ovis during the Infected RAW264．7Macrophage by Real－Time PCR

GE Yangchun1，2，WANG Yuanzhi2，CHEN chuangfu1，DU Junwei1，2
（1College of Animal Science and Technology，Shihezi University，Shihezi 832003，China；2Ministry of Education Key Laboratory of Xinjiang Endemic and Ethnic Disease，Shihezi 832003，China）

To study and research brucella intracellular parasitism mechanism．The test detect the number of intracellular brucellas were described by real－time PCR．Two genes，including B．ovis 019strain 16SrRNA and mouse RAW264．7macrophage GAPDH genes，were cloned．Standard curve of two objective genes were described．The infection model of Brucella invading macrophage was built at different stages．The ratio between B．ovis 019strain 16SrRNA and mouse RAW264．7macrophage GAPDH genes was detected．The results showed the ratio between 16SrRNA and GAPDH slowly rised during 15min－1hafter infection．However，the ratio rapidly rised during 1～4h，which conveyed us the number of intracellular pathogen was significantly enhanced．

Brucella ovis 019strain；RAW264．7macrophage；real－time PCR

S852．65

A

2010－04－06

国家重点基础研究发展计划（973）项目（2010CB530200），国家自然科学基金项目（30800813），新疆兵团博士基金（2009JC15）。

葛阳春（1983－），女，硕士生，专业方向为动物疾病病理学。

王远志（1977－），男，副教授，从事免疫遗传与抗病机制研究；wyzshz＠sina．com。