伴有LEP抵抗、IR现象肥胖大鼠动物模型建立的研究

谈 艳,陈文鹤,孙庆艳

(1.南京邮电大学体育部,江苏南京210046;2.上海体育学院运动科学学院,上海200438)

伴有LEP抵抗、IR现象肥胖大鼠动物模型建立的研究

谈 艳1,陈文鹤2,孙庆艳2

(1.南京邮电大学体育部,江苏南京210046;2.上海体育学院运动科学学院,上海200438)

目的:通过高脂膳食喂养,诱导伴有LEP抵抗、I R现象肥胖大鼠动物模型的建立。方法:采用改进后的高脂膳食喂养大鼠8周,根据体重剔除肥胖抵抗大鼠,选取体重排序前1/3大鼠,观察体重、Lees指数、空腹血糖(FBG)、血清胰岛素(Ins)、胰岛素抵抗指数(HOMA-IR)、血清瘦素(Lep)、口服糖耐量试验(OGTT)、胰岛素释放试验(I RT)等指标,且与对照组比较。结果:除空腹血糖外,模型组各指标均显著高于对照组(P＜0.05)。结论:富含饱和脂肪酸的高脂膳食可以导致大鼠发生肥胖并引起瘦素抵抗、胰岛素抵抗现象。

高脂膳食;肥胖大鼠模型;瘦素抵抗;胰岛素抵抗

脂类代谢紊乱是肥胖症、糖尿病等代谢性疾病的共同病理基础之一。大部分肥胖者同时伴有瘦素(Lep)抵抗和胰岛素抵抗(IR)现象,即体内组织、器官对Lep及Ins敏感性降低。肥胖动物模型的制备是进行各类肥胖症及代谢综合征基础研究的前提之一,由于取材具有一定的损伤性,且肥胖形成周期过长,以人体为受试对象的相关肥胖研究具有一定的局限性[1]。而利用各种方法在短期内诱导肥胖动物模型则不受这些限制,特别是取材方面的限制,这就使得关于肥胖症的研究可以深入到具体组织器官的分子水平。但以往大多数研究未能重视同时具备Lep抵抗和IR现象肥胖动物模型的建立与筛选。因此,笔者试图通过高脂膳食建立肥胖大鼠动物模型并从中筛选出具有这两种抵抗现象的大鼠,初步探讨模型建立的方法和理论,为肥胖症及代谢类疾病治疗和预防的进一步研究奠定实验基础。

1 实验对象与方法

1.1 实验动物分组

健康、雄性纯系7周龄Sprague-Dawley(SD)大鼠130只,体重206～257g,购于上海西普尔—必凯实验动物有限公司,许可证号:准SCXK(沪)2003-0002。参照随机数字表分组,空白对照组(C组,n=10);高脂膳食模型组(H组,n=120)。分笼饲养,每笼5只。室温(22±2)℃,相对湿度55.6%±4%。每日光照黑暗时间各为12小时。自由饮水、活动,不限饲料量,每天早晚两次添加饲料,保证饲料供应。

1.2 动物喂养

标准啮齿类动物饲料适应性喂养7天,然后分别给予对照组和建模组不同成分饲料喂养,连续喂养8周。普通标准啮齿类饲料由中国人民解放军第二军医大学动物实验中心提供,高脂饲料由中国科学院上海实验动物中心上海斯莱克实验动物有限责任公司提供。高脂饲料配方在参考孙志、钱伯初等人方法的基础上改进而成[2-4]。普通饲料中添加10%猪油,15%蔗糖,0.2%胆固醇,0.2%蛋黄及少量维生素和矿物质。高脂饲料低温保存,喂养前复温24小时后给食。普通饲料与高脂饲料主要成分质量与热量比见表1。

1.3 取材

于实验第8周末,大鼠禁食12小时后,空腹进行口服糖耐量试验(OGTT)、胰岛素释放试验(IRT)。以50%的葡萄糖2 g/kg对大鼠进行灌服,分别于灌服葡萄糖15、30、60、120分钟后眼眶静脉取血,以自动血糖仪测即刻及各时间点血糖值,同时分别留取0.5ml血液,离心分离血清后于-20℃保存,以待测血清胰岛素水平。

表1 不同组饲料主要成分质量与热量百分比

1.4 指标测试与方法

1.4.1 体重、Lees指数测定 每周周二统一时间称量体重、测量鼻尖到肛门的长度,计算Lees指数。

Lees指数=体重(g)-3/体长(cm)×103

1.4.2 OGTT试验 自动血糖测试仪测定,血糖试纸为美国Terasense公司提供。

1.4.3 血清 Lep水平以双抗体夹心EL ISA酶联接免疫吸附法(Enzyme-Linked Immunosorbnent Assay)测试,试剂盒为美国R&D公司产品。

1.4.4 I RT试验 以放射免疫法测定血清胰岛素水平,试剂盒为美国L INCO Research公司提供。所测胰岛素值单位为ng/ml,将其转化为mU/L[5]。以上血液指标测定方法、步骤均按试剂盒要求操作。

1.4.5 胰岛素抵抗指数(HOMA-I R)计算 HOMA-IR=空腹胰岛素(F INS)×空腹血糖(FBG)/22.5。

1.5 统计方法

实验数据以均值±标准差(Means±SD)表示,用SPSS13.0 forwindows统计软件处理,采用t检验进行组间比较,P＜0.05为显著性差异,P＜0.01为非常显著性差异。

2 实验结果

2.1 实验过程中大鼠一般状态

实验过程中建模组大鼠体重增长明显快于对照组,但两组大鼠精神状态都良好,皆活动自如,毛发光泽、浓密,紧贴于皮肤表面,眼神明亮,摄食和饮水正常,大小便亦正常。

2.2 造模期间大鼠体重、Lees指数变化

采用不同喂养方式8周后,建模组大鼠体重明显高于对照组,筛选建模组体重排序前1/3的40只大鼠与对照组比较[6]。建模组体重与Lees指数与之都具有显著性差异(P＜0.01),提示高脂膳食诱导肥胖大鼠动物模型建模成功(表2)。

表2 喂养8周后建模组与对照组体重、Lees指数比较(M eans±SD)

2.3 建模后大鼠血清瘦素、血糖和胰岛素、胰岛素抵抗指数的变化

不同种类膳食喂养8周后,除FBG外其余各指标,建模组较对照组都有显著性差异(P＜0.01)(表3)。

表3 喂养8周后建模组与对照组血糖、血清瘦素、胰岛素及胰岛素抵抗指数比较(M eans±SD)

2.4 大鼠OGTT试验

由表4及图1可见,建模组与对照组大鼠在空腹时血糖水平无差异性,但在15min、30min、60min及120min各时间点,建模组大鼠血糖明显高于对照组(P＜0.05)。两组大鼠血糖浓度均在60min时达到峰值。

表4 建模组与对照组OGTT试验结果(mmol/L)(M eans±SD)

图1 建模组与对照组大鼠OGTT试验结果

2.5 大鼠IRT试验

如表5及图2所示,整个I RT各时间点,建模组与对照组均具有显著性差异(P＜0.01),两组大鼠血清胰岛素浓度均在15min时出现峰值。

表5 建模组与对照组IRT试验(mU/L)(M eans±SD)

图2 建模组与对照组IRT试验结果

3 分析与讨论

1959年,Masek首次通过高脂膳食干预诱导了大白鼠肥胖动物模型,并对高脂膳食进行了描述[7]。后续的研究也发现,高脂膳食不仅能够造成肥胖,同时还能够引起机体高血糖症、脂代谢紊乱及胰岛素抵抗等[8,9]。大多数研究中的高脂膳食是相对于标准普通膳食而言的,没有具体分析不同脂肪成分对动物模型的影响,造成了不同的研究结果。Buettner[10]给予W istar大鼠42%能量来源于不同脂肪成分的高脂饮食,包括猪油(HF-L)、橄榄油(HF-O)、椰子油(HF-C)和鱼油(HF-F),结果HF-L、HF-O大鼠出现预期的肥胖和胰岛素抵抗,而HF-C、HF-F组的胰岛素敏感指数接近于正常。该实验提示富含饱和脂肪酸的动物脂肪更容易诱导肥胖。因此,本实验中采用以猪油为主要脂肪来源的高脂饲料,以利于肥胖大鼠动物模型的建立。

高脂饲料配制比例是否合理是营养性肥胖动物模型是否成功的决定因素之一。以往文献中高脂膳食诱导肥胖模型中脂肪质量比通常在20%～35%之间,热量比占45%～60%[2,11]。但实际操作中,由于含有较高的油脂,大鼠饲料松散易碎很难成形,不仅造成了大量饲料浪费,而且不适于有喜用硬物磨牙习性的大鼠,导致大鼠不爱啃食,进食量减少,所以很难达到较好的实验效果。参考已有的饲料配方,反复配制比较,本研究将脂肪质量比调至13.9%,碳水化合物质量比升至53.8%,以增加热量的摄入。但同时也保证蛋白供应量,避免蛋白质比例过度下降,影响大鼠的生长发育。改进后的高脂饲料干燥成形,松软适度,符合大鼠进食磨牙的生活习性,保证了其膳食摄入量,同时饲料成本降低,易于储存。

高脂膳食并不能绝对地引起大鼠发生肥胖。1983年,人们首次提出了“肥胖抵抗”(D IO-R)的概念[12]。D IO-R是指进食高脂膳食而不发生肥胖的现象。已有的研究也证实了高脂饮食诱导肥胖动物模型时D IO-R的存在,通常认为它的发生率是30%～40%左右[2,13]。高脂膳食诱导下发生D IO-R的机制有[14-16]:①脂肪氧化速率不同,D IO-R个体具有较强的脂肪氧化能力,从而避免了脂肪沉积和肥胖的发生。②D IO-R个体神经内分泌系统中含有较多的抑制外源性脂肪摄入及促进脂解的激素,如:γ-氨基丁酸(GABA)、生长激素(GH)等。③大鼠体内的肌纤维类型比例不同。④遗传因素的不同。本研究参考已有的文献,高脂膳食喂养8周后,把造模组体重在后1/3位的判定为D IOR大鼠,中间1/3大鼠弃之不用[6,17]。前1/3的40只大鼠对空白对照组比较,体重与Lees指数与之都有显著性的增高,提示高脂膳食诱导肥胖大鼠造模成功。

瘦素是脂肪组织分泌的众多脂肪细胞因子之一,在中枢主要生理功能是通过和受体结合,抑制摄食行为及增加能量消耗,这也是瘦素最重要的生理功能。在外周作用则包括对糖代谢平衡的调节、促进脂肪分解、抑制脂肪合成等。虽瘦素在中枢和外周可以通过各种途径调节能量平衡,控制体重,但是大多数肥胖者体内却存在高瘦素水平,只有约5%的肥胖者体内呈低瘦素水平[18]。这提示肥胖者大多存在瘦素抵抗现象,瘦素抵抗可能是形成肥胖症的病理基础之一。

血液循环中瘦素浓度受昼夜节律、机体脂肪含量、激素、胰岛素等多种因素的影响。有研究认为循环瘦素水平与机体摄入碳水化合物总量有显著的相关性[19]。本实验中,经过8周高脂膳食喂养,造模组大鼠血清瘦素水平显著高于对照组,提示造模组大鼠体内存在瘦素抵抗现象。造模组大鼠体内高瘦素水平,可能是由于热能摄入过多,导致体重上升,脂肪堆积,从而使脂源性的细胞因子瘦素浓度上升。同时,脂肪组织中的巨噬细胞的数量可以在高脂膳食诱导下上升,从而导致机体处于一种炎性状态,白介素-6( IL-6)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)水平增加,这些炎性因子可以刺激瘦素分泌,加重瘦素抵抗现象。当内源性瘦素水平持续增高后,机体可能出于一种自我防御机制,降低对瘦素的敏感性,或者存在瘦素受体及受体后缺陷,瘦素不能发挥其正常的生理调节作用,从而使建模组大鼠一直处于肥胖且伴瘦素抵抗状态。

流行病学表明,大多数肥胖者同时具有瘦素抵抗和胰岛素抵抗现象。胰岛素抵抗通常是指胰岛素作用的靶组织或器官对于胰岛素的敏感性下降或者体内正常水平的胰岛素不能产生相适应的生物学效应。高脂、高热量食物的大量摄入被认为是胰岛素抵抗形成的主要因素之一。本实验中建模组大鼠经过8周高脂饲料喂养后,与对照组相比,体重、F INS与HOMA-IR都具有显著差异,提示建模组大鼠具有高胰岛素血症、胰岛素抵抗现象。这与以往4～6周高脂膳食导致大鼠发生胰岛素抵抗研究结果相符[20,21]。血糖钳夹技术是目前评价胰岛素抵抗的金标准,但是由于操作的复杂性、实验现实条件等原因,本研究采用了稳态模型评估的HOMA-I R间接评价胰岛素抵抗。而已有实验证明,以大鼠为受试对象,HOMA-I R与血糖钳夹技术测定的胰岛素抵抗指数(clamp-I R)具有高度的相关性[22]。图2所示的IRT试验中,建模组与对照组在各时间点上都有显著性差异,这提示了建模组大鼠胰岛β细胞的分泌功能还未显著受到高脂饮食的影响,在血糖的刺激下仍具有正常分泌功能,大鼠还处于胰岛素抵抗阶段并未发展成2型糖尿病。但也有许多观点认为高脂膳食可以导致机体胰岛β细胞功能在2型糖尿病发生之前出现代偿性功能下降[23,24]。

OGTT通过观察机体在进食葡萄糖后对血糖的调节能力,是一种用于早期发现糖代谢异常的经典方法[25]。Andrikopoulos对高脂膳食饲养八周后的大鼠以2g/kg体重的葡萄糖量进行OGTT试验,发现相对于普通膳食对照组,其血糖浓度显著上升[26]。本实验中,在进食葡萄糖后,两组大鼠血糖均有升高趋势,同时在1小时后达到峰值,后血糖水平逐渐回落。但高脂膳食除空腹外,造模组各个时间点血糖值均显著高于对照组,提示造模组大鼠葡萄糖耐量降低,存在血糖调节异常。

建模组大鼠FBG与对照组无显著性差异,说明此时胰岛素对机体血糖还具有一定的调节作用,大鼠并未出现糖代谢异常。但是肥胖大鼠由于存在胰岛素抵抗现象,效应器官对胰岛素的敏感性下降,高脂膳食后胰岛素作用不足,降低了通过门静脉的葡萄糖摄取能力,导致血糖升高。OGTT试验中除了空腹血糖,其他各时间点建模组大鼠血糖浓度高于对照组,且具有显著性差异,表明了建模组大鼠血糖调节能力低下,胰岛素的分泌不能及时地适应和调节机体突然增加的血糖浓度,导致血糖水平急剧上升,而这符合胰岛素抵抗特征。

4 结论与建议

1)富含饱和脂肪酸的高脂膳食可以诱导建立大鼠肥胖模型,并引起瘦素抵抗、胰岛素抵抗现象,该动物模型的建立为肥胖症及代谢类疾病的发病机制、治疗和预防措施等理论研究奠定了基础。

2)大鼠喂养过程中存在D IO-R现象,在模型制备前应考虑到D IO-R大鼠的发生率及剔除。

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责任编辑:乔艳春

Establishment of Obesity Rat An imalM odel with Leptin Resistance and Insul in Resistance

TAN Yan1,CHEN W enhe2,SUN Q ingyan2
(1.P.E.School,N anjing U niversity of Posts and Telecomm unications,N anjing210046,Jiangsu,China;2.School of Kinesiology,Shanghai Sport U niversity,Shanghai200438,China)

Objective:To establish the obesity rat anim alm odelw ith leptin resistance and insulin resistance through high fat diet.M ethods:Rats w ere fed w ith improved high fat diet for8w eeks.To observe the indexes:weight,Lees index,fasting blood glucose,insulin,HOMA-IR,leptin,oral glucose tolerance test,insulin release test and compared w ith control group rats.Results:Besides FBG,the indexes of m odel group rats w ere significantly higher than control group rats(P＜0.05).Conclusions:H igh saturated fatty acid diet can induce obesity rat w ith leptin resistance and insulin resistance.

high fat diet;obesity rat m odel;leptin resistance;insulin resistance

G804.2

A

1004-0560(2010)06-0087-04

2010-09-13;

2010-10-15

上海体育学院研究生教育创新计划项目(yjscx2009b03)。

谈 艳(1974-),女,讲师,博士研究生,主要研究方向为运动生理学。