洗脱剂极性对硅胶柱分离人参皂苷C-K的影响

庄 子 瑜，肖 永 坤，富 瑶 瑶，鱼 红 闪，金 凤 燮

( 大连工业大学 生物与食品工程学院， 辽宁 大连 116034 )

0 引 言

人参皂苷C-K(compound-K)在天然的人参中并不存在，是原人参二醇类皂苷(Rb1、Rb2、Rc、Rd等)在肠道内的降解产物，也就是说人参皂苷C-K是原人参二醇类皂苷在人肠道内代谢的末端产物[1]，其结构如图1。近年来诸多研究表明，人参皂苷C-K具有很好的药理和保健功能，它对多种实体和流体肿瘤细胞具有杀伤力，同时具有抗突变[2]、抗癌[3]、抗过敏[4-5]、抗搔痒[6]、抗糖尿病[7-8]，增强机体免疫力等作用。

图1 人参皂苷C-K的结构

本实验室进行了酶转化生产人参皂苷C-K的研究，鱼红闪等[9]发现了人参皂苷糖苷酶I型酶，该酶水解人参二醇类皂苷(Protopanaxadiol type ginsenoside，PPD)Rb1、Rb2、Rc和Rd的第3(碳)-O-和20(碳)-O-糖基，生成人参皂苷C-K；王亮等[10]发现一种新细菌，能够将人参二醇类皂苷转化为人参皂苷C-K。本实验室还对大量制备人参皂苷C-K进行了研究，郑长龙[11]研究了硅胶柱层析法分离纯化酶解物人参皂苷C-K粗品，得到了纯度较高的人参皂苷C-K；李翠翠[12]以工业化生产为目的，利用粗品人参皂苷C-K为原料，通过大孔吸附树脂脱色、脱脂及硅胶层析法分离纯化，得到纯度较高的人参皂苷C-K。上述研究中硅胶柱分离人参皂苷C-K纯品得率尚不理想，因此，本论文主要研究了硅胶柱层析法分离纯化人参皂苷C-K过程中洗脱剂极性对产品得率的影响，以便提高人参皂苷C-K纯品得率。

1 材料与方法

1.1 材 料

酶转化人参皂苷C-K及其标准品，大连生生绿谷提供；薄层层析板Silica gel 60-F254，德国Merck公司产品；高效液相色谱仪 2695-2996，美国Waters公司制造。

1.2 方 法

1.2.1 石油醚除杂

利用索氏提取器，采用石油醚萃取酶转化后的人参皂苷C-K样品，重复萃取数次，每次20 min，薄层层法检测萃取结果。

1.2.2 硅胶柱层析分离

称取30 g除杂后的人参皂苷C-K样品溶于甲醇中，加入80～100目的硅胶75 g，加热搅拌，蒸干，制成样品胶，再取300～400目硅胶450 g作为分离胶。

用3种不同极性的洗脱剂分别洗脱，(1)V(氯仿)∶V(甲醇)=9.5∶0.5；(2)V(氯仿)∶V(甲醇)=9.0∶1.0；(3)先用V(氯仿)∶V(甲醇)=9.5∶0.5洗脱，人参皂苷C-K单点出现后再用V(氯仿)∶V(甲醇)=9.0∶1.0洗脱。收集流出液，每瓶250 mL，薄层层析法跟踪检测洗脱结果。

1.2.3 薄层层析法(TLC)

本实验采用刻度毛细管吸取标准品及样品，点样于薄层层析板上。将点好样品的薄层板放入层析缸的展开剂中，所用展开剂为V(氯仿)∶V(甲醇)∶V(水)=7∶3∶0.5，浸入展开剂的深度为距薄层板底边0.5～1.0 cm (切勿将样点浸入展开缸中)，密封盖。待展开至规定距离后，取出，吹干溶剂，喷洒10%硫酸加热显色。

1.2.4 高效液相色谱(HPLC)检测产品纯度

色谱仪，美国Waters 2695仪器；检测器，Photodiode Array Detector Waters 2996仪器；色谱柱，Hypersil ODS 2 5 μm (4.6 mm×200 mm)；工作温度，20 ℃；柱温，35 ℃；体积流量，1.0 mL/min；样品进样量，10 μL；检测波长，203 nm。采用乙腈-水体系梯度洗脱，洗脱条件见表1。

表1 高效液相色谱流动相梯度条件

2 结果与讨论

2.1 样品除杂

为了获得更纯净的人参皂苷C-K，借助索氏提取器除杂。称取酶转化后得到的人参皂苷C-K粗产品120 g，用240 mL石油醚萃取数次，每次萃取20 min，蒸干，得到样品102 g，除杂率为15%。采用石油醚萃取可将杂质基本除掉，TLC检测如图2。

标，人参皂苷C-K标准品；样，人参皂苷C-K样品；1，萃取人参皂苷C-K样品后的石油醚溶液；2，萃取后的人皂苷样品；展开剂为V(氯仿)∶V(甲醇)∶V(水)=7∶3∶0.5，10%H2SO4加热显色

图2 石油醚萃取人参皂苷C-K

Fig.2 Extraction ginsenoside C-K by petroleum ether on TLC

2.2 3种不同极性的洗脱剂对人参皂苷C-K分离效果的比较

2.2.1 采用V(氯仿)∶V(甲醇)=9.5∶0.5洗脱剂洗脱

称取石油醚萃取、干燥后得到的人参皂苷C-K样品30 g进行硅胶柱分离，使用V(氯仿)∶V(甲醇)=9.5∶0.5作为洗脱剂，第1～13瓶为色素，第14～24瓶为色素与C-K的混合物，第25～55瓶为C-K单点，第56～92瓶为人参皂苷C-K与其他皂苷的混合物，第93～94瓶为混有人参皂苷F2的混合物，TLC检测结果如图3。

根据TLC检测结果，将洗脱出来的人参皂苷分别收集、浓缩、干燥、称重。各部分皂苷重量见表2。

标，标准品C-K；样，分离前样品；数字，瓶号；展开剂为V(氯仿)∶V (甲醇)∶V(水)=7∶3∶0.5，以10%H2SO4为显色剂

表2 以V(氯仿)∶V(甲醇)=9.5∶0.5为洗脱剂的人参皂苷分离收集表

Tab.2 The form of ginsenosides separation collection [V(chloroform)∶V( methanol)=9.5∶0.5]

瓶号分离产物成分m(得到样品)/g得率/%1～1314～2424～5556～9293～94损失色素色素+C-K C-KC-K+其他皂苷F2(含杂质)3.04.011.253.957.40.410.0013.3337.5013.1724.671.33

从表2可以观察到：以V(氯仿)∶V(甲醇)=9.5∶0.5的洗脱剂洗脱，得到人参皂苷C-K 11.25 g，得率为37.5%，得率较高，分离效果较好，达到了分离要求。

2.2.2 采用V(氯仿)∶V(甲醇)=9.0∶1.0洗脱剂洗脱

称取石油醚萃取后的人参皂苷C-K样品30 g进行硅胶柱分离，用V(氯仿)∶V(甲醇)=9.0∶1.0的洗脱液洗脱，采用TLC跟踪检测，第1～10瓶为色素与C-K的混合物，第11～13瓶为C-K单点，第14～60瓶为C-K与其他皂苷的混合物，第61～65瓶为含人参皂苷F2的混合物。将洗脱出来的人参皂苷分别收集、浓缩、干燥、称重，各部分皂苷重量见表3。

表3 以V(氯仿)∶V(甲醇)=9.0∶1.0为洗脱剂的人参皂苷分离收集表

Tab.3 The form of ginsenosides separation collection [V(chloroform)∶V(methanol)=9.0∶1.0]

瓶号分离产物成分m(得到样品)/g得率/%1～1011～1314～6061～65损失色素+C-K C-KC-K+其他皂苷F2(含杂质)16.653.028.151.980.2055.5010.0727.176.600.67

从表3可以看出，以V(氯仿)∶V(甲醇)=9.0∶1.0的洗脱剂洗脱，仅能得到3.02 g纯品C-K，得率为10.07%，得率较低。色素及其他皂苷中含有较高的人参皂苷C-K，分离效果不好，不能达到分离要求。

2.2.3 采用V(氯仿)∶V(甲醇)=(9.5∶0.5)+[V(氯仿)∶V(甲醇)=(9.0∶1.0)]联合作为洗脱剂洗脱

称取石油醚萃取后的人参皂苷C-K样品30 g进行硅胶柱分离，先用V(氯仿)∶V(甲醇)=9.5∶0.5洗脱，C-K单点出现后再用V(氯仿)∶V(甲醇)=9∶1洗脱，采用TLC跟踪检测，第1～13瓶为色素，第14～25瓶为色素与C-K的混合物，第25～55瓶为C-K单点，第56～92瓶为C-K与其他人参皂苷的混合物，第93～95瓶为人参皂苷F2等杂质。将洗脱出来的人参皂苷分别收集、浓缩、干燥、称重，各部分皂苷重量见表4。

表4 以V(氯仿)∶V(甲醇)=(9.5∶0.5)+[V(氯仿)∶V(甲醇)=(9.0∶1.0)]联合作为洗脱剂的人参皂苷分离收集表

Tab.4 The form of ginsenosides separation collectionV(chloroform)∶V(methanol)=9.0∶1.0+[V(chloroform)∶V( methanol)=9.5∶0.5]

瓶号分离产物成分m(得到样品)/g得率/%1～1314～2525～5556～9293～95损失色素色素+C-KC-KC-K+其他皂苷F2(含杂质)2.894.266.4011.844.280.439.9314.221.3339.4714.171.43

从表4可以看出，人参皂苷C-K的产量为6.40 g，得率为21.33%。以此浓度梯度洗脱，人参皂苷C-K不能与其他皂苷很好地分离，与V(氯仿)∶V(甲醇)=9.5∶0.5作为洗脱剂相比，效果较差。

2.2.4 3种不同极性洗脱剂分离人参皂苷C-K的结果比较

由表5可见，采用V(氯仿)∶V(甲醇)=9.5∶0.5作为洗脱剂的分离效果最好，产率为37.5%，得到11.25 g人参皂苷C-K；采用V(氯仿)∶V(甲醇)=9.0∶1.0作为洗脱剂的分离效果最差，产率10.07%，仅得到3.02 g人参皂苷C-K，不能达到分离要求；采用V(氯仿)∶V(甲醇)=9.5∶0.5与V(氯仿)∶V(甲醇)=9.0∶1.0联合作为洗脱剂的分离方法，其产率为21.33%，得到人参皂苷C-K 6.40 g，效果一般，因此，无论从得率，还是从得到产品质量来看，V(氯仿)∶V(甲醇)=9.5∶0.5都是最优洗脱条件，在此洗脱条件下，人参皂苷C-K分离最完全。

表5 3种不同极性洗脱剂分离人参皂苷C-K效果比较表

2.3 高效液相色谱分析人参皂苷C-K纯度

为进一步确定V(氯仿)∶V(甲醇)=9.5∶0.5的洗脱剂洗脱效果，对其分离出的人参皂苷C-K进行高效液相色谱分析。取1 mg人参皂苷C-K溶于1 mL色谱甲醇进行HPLC检测，其色谱图如图4所示。

图4 人参皂苷C-K HPLC图谱

从图4可以看出，V(氯仿)∶V(甲醇)=9.5∶0.5的洗脱剂分离效果很好，仅有微量杂峰，达到了分离要求，分离后的人参皂苷C-K纯度在98%以上。

3 结 论

稀有人参皂苷C-K样品120 g经石油醚除去杂质，得到102 g人参皂苷C-K粗产品，除杂率为15%。3种不同极性洗脱剂分别对30 g人参皂苷C-K进行分离比较，发现以V(氯仿)∶V(甲醇)=9.5∶0.5作为洗脱剂，得到人参皂苷C-K 11.25 g，得率为37.5%，得率较高。以V(氯仿)∶V(甲醇)=9.0∶1.0的作为洗脱剂，仅能得到3.02 g纯品人参皂苷C-K，得率为10.07%，得率较低。以V(氯仿)∶V(甲醇)=(9.5∶0.5)+[V(氯仿)∶V(甲醇)=(9.0∶1.0)]联合作为洗脱剂，人参皂苷C-K的产量为6.40 g，得率为21.33%，效果一般，由此可知，根据相似相容原理，V(氯仿)∶V(甲醇)=9.5∶0.5的洗脱剂对人参皂苷C-K溶解较好，因此，分离效果较好。用V(氯仿)∶V(甲醇)=9.5∶0.5洗脱剂洗脱得到的稀有人参皂苷C-K经高效液相色谱检测发现纯度可达98%以上。

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