一种简单准确的L-苏氨酸测定方法

张君胜,解晓鹏,杨晓志,张 力

(江苏畜牧兽医职业技术学院,江苏泰州 225300)

一种简单准确的L-苏氨酸测定方法

张君胜,解晓鹏,杨晓志,张 力＊

(江苏畜牧兽医职业技术学院,江苏泰州 225300)

通过研究建立了发酵液中L-苏氨酸定性和定量测定的“纸层析-Rf值法”和“纸层析-色斑洗脱比色法”,并对该方法的应用条件进行了研究。研究结果表明,该法对测定L-苏氨酸含量具有较高的准确度和精密度。而且该法操作简单、易于掌握,非常适合在L-苏氨酸产生菌筛选中应用。

L-苏氨酸;纸层析法;测定

苏氨酸(Threonine)是人体和动物的必需氨基酸,在人和动物的生长发育中发挥着重要作用,被广泛应用于饲养业、食品业以及医疗业等方面,目前工业化生产L-苏氨酸主要采用直接发酵法[1]。在L-苏氨酸的发酵生产中,建立一种快速高效的氨基酸测定方法对于菌种选育和发酵控制优化是至关重要的。用氨基酸分析仪、高效液相色谱仪等可以准确测定L-苏氨酸和苏氨酸含量,但是成本昂贵,但由于在菌种选育及发酵条件优化的实验研究中需要测定的样品多、工作量大和受设备条件限制,因而非常需要建立更切合实际、比较简单快速的定性定量分析方法。据文献报道[2-3],用纸层析法分离测定发酵液中的氨基酸,简单易行,不需要氨基酸分析仪等大型仪器,准确率高,但没人用此方法做过苏氨酸的检测。本研究对纸层析法-分光光度法测定发酵液中L-苏氨酸进行了系统地研究,这对于L-苏氨酸产生菌的筛选具有重要的意义。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试剂 层析展开液(正丁醇∶冰乙酸∶水=12∶3∶5,体积比);显色液(0.5%茚三酮溶液:称取0.5 g茚三酮用丙酮定容到100 mL);洗脱液(0.1%CuSO4∶75%乙醇=2∶38,体积比);L-苏氨酸、L-谷氨酸、L-脯氨酸和L-谷氨酰胺标准液(准确称取一定量氨基酸溶于一定量的蒸馏水中,水浴加热溶解,配成不同浓度的标准液)。

1.1.2 主要仪器 水域恒温振荡器,江苏金坛金城国胜试验仪器厂;722分光光度计,上海分析仪器厂;800B离心机,上海安亭科学仪器厂;电子分析天平(精度0.001 g),上海天平仪器厂。

1.2 方法

1.2.1 发酵液预处理 吸取0.5 mL发酵液于1.5 mL小离心管中,高速离心沉淀固形物,上清液置于4℃冰箱中待测。根据发酵液中L-苏氨酸浓度确定样品稀释倍数。

1.2.2 发酵液的点样和层析 裁取30 cm长、22 cm宽的新华3号滤纸,注意使滤纸的纤维方向与短边一致。在距滤纸长边边线2 cm处用铅笔画一直线,每隔2 cm设一点样点标记。将氨基酸标准液或己处理好的待测样品,对应点在滤纸的相应点样点上,自然晾干或用电吹风吹干。每次点样量为1μL,可多次点样,点样直径控制在4 mm内。将点好样的滤纸卷成圆筒状,缝好后置于装有约5 mm深的展开剂的层析缸内,平衡1 h后放下滤纸,让展开剂前沿上行至距离滤纸顶端2 cm时取出滤纸,置于通风橱内风干。用喉头喷雾器将层析区均匀喷上显色剂,于105℃恒温干燥箱内显色10 min。

1.2.3 发酵液“纸层析-氨基酸Rf法”定性测定L-苏氨酸 溶质在层析纸上移动的速度用比移值Rf,Rf=原点到层析点中心的距离/原点到溶剂前沿的距离[4]。发酵液样品经纸层析分离、显色后,由于不同氨基酸色斑的Rf值不同和不同氨基酸与吲哚醌呈色不同,因此,可依据Rf值大小和色斑呈色定性:样品L-苏氨酸色斑与标准L-苏氨酸色斑的Rf值大小一致,和吲哚醌反应呈桔黄色确定发酵液中是否含苏氨酸[5]。

1.2.4 以“纸层析-色斑洗脱比色法”定量测定L-苏氨酸[6-7]在滤纸完全显色后,以相同面积剪下整个L-苏氨酸显色斑点,然后剪成细条状放于试管中,加入洗脱液7 mL,加盖振荡洗脱30 min迅速取出在波长508 nm下测定吸光度。以不同浓度L-苏氨酸标准液显色斑点对应的吸光度为纵坐标,L-苏氨酸含量为横坐标,绘制L-苏氨酸测定标准曲线。由标准曲线的直线回归方程推导出发酵液中L-苏氨酸含量计算公式。每次测定时,剪下与样品斑点面积相当的无色斑点的滤纸作空白对照。根据标准曲线即可计算出发酵液中的L-苏氨酸含量。

2 结果和讨论

2.1 展开剂的选择

依据24种氨基酸的Rf值和吲哚醌显色可以分离发酵液中的氨基酸,但几种氨基酸Rf值相差小于0.1时,色斑容易重叠影响氨基酸的分离,故需在定性定量测定时把文献[5]和文献[8]中苏氨酸Rf相近的谷氨酸、脯氨酸和谷氨酰胺3种氨基酸分离。依据相秉仁、安登魁等[9]的《22种氨基酸的纸层析溶剂系统最佳组合选取方法的研究》和罗治权[10]的《14种氨基酸纸层析系统的最佳选取》选择展开剂体系为正丁醇∶冰乙酸∶水。4种氨基酸配制的标准液和此4种氨基酸的混合液分别点样,分别用展开剂体系为不同比例的正丁醇∶冰乙酸∶水进行考察层析剂对L-苏氨酸测定的影响。从表1可以看出,展开剂为正丁醇∶冰乙酸∶水=12∶3∶5时,上述4种氨基酸分离效果最好,斑点之间的Rf值差距较大,而且发现各氨基酸的层析斑点没有脱尾现象,呈圆形斑点,便于定量测定。

表1 L-苏氨酸在各种层析溶剂中展开结果比较Table 1 The deployment result of L-threonine in solvent systems

2.2 测定显色剂的选择

茚三酮、吲哚醌均为较常用的氨基酸显色剂。L-苏氨酸发酵液样品经纸层析分离后,分别用茚三酮、吲哚醌来显色(吲哚醌显色后需褪出底色),显色情况见表2。

表2 不同显色剂与L-苏氨酸的显色情况Table 2 Color development of L-threonine with different color

由表2结果可知,吲哚醌对L-苏氨酸显色的最低含量比茚三酮高,即茚三酮具有更高的灵敏度。采用茚三酮显色可以检出发酵液样品中微量的L-苏氨酸,有利于L-苏氨酸生产菌的筛选,同时,在实验过程中还发现,用吲哚醌显色、褪色后的滤纸表面有一层白色结晶物。而且滤纸很脆,色斑也不能被洗脱进行定量分析。因此,选用茚三酮作为定量测定L-苏氨酸的显色剂比较合适。

2.3 最佳吸收波长的确定

显色后的色斑用剪纸洗脱法进行定量分析时,是否选用合适的吸收波长对测定准确性影响很大。点样分别为10 g/L和5 g/L的L-苏氨酸标准液0.4μL,洗脱后选用不同的吸收波长测定其吸光度的变化情况,结果见图1。由图1可知,随着吸收波长的变化,点样10 g/L和5 g/L的L-苏氨酸标准液,有相同变化规律,在光密度为508 nm时有最大吸光度,所以测定时选用吸收波长在508 nm较为合适。

图1 吸收波长与吸光度关系Fig.1 Relationship between absorbency and absorb wavelength

2.4 颜色稳定性测定

将点样分别为10 g/L和5 g/L的L-苏氨酸标准液0.4μL的显色斑点的洗脱液,于30℃放置不同的时间,测定洗脱液的吸光度(OD508nm),结果见图2。由图2可知,色斑洗脱液在放置时间超过60 min后,吸光度下降。实验还发现,洗脱液放置24 h后不同含量的L-苏氨酸的OD值基本相同,无法进行定量分析。在洗脱后60 min内颜色比较稳定。在这个时间范围内,可以采用茚三酮比色法定量测定L-苏氨酸含量。

2.5 吸光度与L-苏氨酸含量关系的测定

分别点2、5、10、20、40、60、80、100、120、140、160、180、200μg的L-苏氨酸,以正丁醇∶乙酸∶水=12∶3∶5为展开剂,以5 g/L茚三酮丙酮溶液为显色剂,于105℃显色10 min,用洗脱液洗脱30 min后,在508 nm的波长下分别测定其吸光度,结果见图3。由图3可见,当滤纸点样量大于80μg时,洗脱液的值偏低,不能准确测定苏氨酸的量。因此,采用纸层析法定量测定苏氨酸,滤纸上苏氨酸含量在2～80μg时比较合适。而在滤纸上样品溶液的点样量为1～20μL较为适宜,这就要求样品在采用纸层析法进行定量分析时,应选择合适的稀释度。

图2 洗脱液放置时间与吸光度的关系Fig.2 Relationship between absorbency and preserving time of eluent

2.6 L-苏氨酸标准曲线的绘制

由图4可见,苏氨酸含量与OD值之间形成一条密切的直线关系。采用过原点线性回归,得到如下回归方程:Y=0.0423X(Y表示OD值,X表示L-苏氨酸浓度)其相关系数为R=0.9958。这说明L-苏氨酸含量与OD值之间线性回归比较显著。由此可以推出发酵液中L-苏氨酸含量计算公式:X=23.36×OD×N/V,式中:X:发酵液中L-苏氨酸含量(g/L);OD:吸光度;N:待测样品稀释倍数;V:点样体积(μL)。

图4 L-苏氨酸测定标准曲线Fig.4 The deter mination standard curve of L-threonine

2.7 回收实验

为了检测方法的准确性,将不同含量L-苏氨酸的发酵液点在滤纸上(本底量),再用标准液点量6.0μg,测定其回收率,结果见表3。如表3所示,5次测定的平均回收率101.8%,由此可见,该方法测定L-苏氨酸含量有较好的准确度。

表3 纸层析法测定L-苏氨酸的回收率Table 3 Recovery of L-threonine content by paper chromatography

2.8 方法的重复性试验

对5.0μgL-苏氨酸进行5次重复测定,测定结果见表4。

表4 重复性试验结果Table 4 Repeatability of test results

由表4可见该方法变异系数低于1%,说明其精密度高、重复性好。由此可见本研究建立的方法,不但可以将发酵液中L-苏氨酸和其他氨基酸分开而且还可以定量测定发酵液中苏氨酸。

3 总 结

研究确定了定性测定发酵液中苏氨酸鉴定分离的“纸层析—色斑显色和Rf值”中层析液配比为正丁醇∶冰乙酸∶水=12∶3∶5,最佳显色剂为茚三酮。确立了定量测定发酵液中L-苏氨酸的“纸层析—色斑洗脱比色法”:每次点样1～20μL,点样斑点直径控制在4 mm内;层析分离、风干后以0.5%茚三酮溶液显色,105℃显色10 min;以相同面积剪下整个L-苏氨酸显色斑点,振荡洗脱30 min;取出后在60 min内、波长508 nm下测定吸光度;由L-苏氨酸测定标准曲线得出的发酵液中L-苏氨酸含量计算公式:X=23.36×A×N/V。

本实验表明,用纸层析—分光光度法测定发酵液中L-苏氨酸含量具有较高的准确度和精密度,线性相关显著,而且操作方便、易于掌握,所用仪器较简单,适合条件一般的实验室应用,在L-苏氨酸产生菌筛选中非常适用。尤其是在菌种选育过程中,初筛时可以比较样品L-苏氨酸色斑与标准梯度的L-苏氨酸色斑大小和颜色深浅,粗略估计L-苏氨酸产量,简单快捷。

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A Simple and Accurate Method to Determine of L-threonine

ZHANG Jun-sheng,Xie Xiao-peng,YANG Xiao-zhi,ZHANG Li
(Jiangsu Animal Husbandry&Veterinary College,Taizhou,Jiangsu225300)

Paper chromatograghy-Rf and chromatograghy-mottle elution chromometry was established to determine L-threonine concentration qualitatively and quantitatively in the fermentation broth.The application conditions of this method were studied.The results showed that the method was highly accurate and precise in the deter mination of L-threonine.The method was easy to operate and master,very suitable to use in screening L-threonine producing strains.

L-threonine;paper chromatograghy;deter mination

Q93-3;S816

B

1005-7021(2010)06-0097-04

张君胜 男,讲师。研究方向为微生物育种与发酵。E-mail:napzjs@163.com

＊通讯作者。Tel:0523-86158368,E-mail:zhangli2118@sohu.com

2010-08-31;

2010-10-25