二维液相色谱分离中药复方银黄口服液中的有效成分

刘文翔

(陕西师范大学化学与材料科学学院 ,陕西西安 710062)

二维液相色谱分离中药复方银黄口服液中的有效成分

刘文翔

(陕西师范大学化学与材料科学学院 ,陕西西安 710062)

建立了二维液相色谱方法分离中药复方银黄口服液的成分。按照中国药典银黄口服液项下比例制备[1],以 CN柱作第一维色谱柱,甲醇和 0.1%甲酸水溶液梯度洗脱分离;以 C18柱作第二维色谱柱,乙腈和 0.1%甲酸水溶液梯度洗脱分离。搭建的二维液相色谱的峰容量显著高于一维色谱,分离效率得到了明显的提高。该方法操作简便,可作为中药等复杂体系分离分析的有效手段。

二维液相色谱;银黄口服液;活性成分

多维液相色谱分离技术 (MDLC)是利用两根或多根性质不同的色谱柱对复杂样品中的待分析组分进行分离[2]。不同的液相色谱模式如排阻色谱(SEC)、亲和色谱 (AC)、离子交换色谱 (IEC)、疏水作用色谱 (H I C)、反相色谱 (RPC)等都可以用来组合、构建多维液相色谱。根据对一维洗脱流分进行后续分离的连续性,多维色谱分离可以分为离线模式和在线模式。Giddings指出,多维色谱的总峰容量 (P)等于每一维的峰容量 (Pi)的乘积,即:P=P1×P2×P3×…[3]。因此从理论上可知,多维色谱分离系统比一维色谱可提供更高的峰容量,更适合于复杂体系的分离。

银黄口服液是由唇形科植物黄芩的干燥根与忍冬科植物金银花的干燥花药材提取加工而成,具有抗菌、清热解毒、消炎、退热等作用,临床上广泛应用于上呼吸道感染、急慢性扁桃体炎、咽喉炎等症的治疗。其中原料药材黄芩为常用中药,具有清热燥湿、泻火解毒、止血安胎等功效[4]。它的药用历史悠久,有效成分众多,其中含量较高的活性成分有黄芩苷、汉黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素等[5]。原料药材金银花也为常用的中药,同样具有清热解毒、凉散风热之功效。它的主要有效成分为绿原酸及异绿原酸,也含有有机酸类、三萜类、黄酮类、挥发油类等成分[6]。其复方口服液的有效成分则更为复杂。

目前对复方银黄口服液的研究报道较少,本文采用二维液相色谱对复方银黄口服液进行了研究,从而对复方银黄口服液能够进行更好的质量控制。

1实验部分

1.1仪器与试剂

仪器:LC-20AB岛津高效液相色谱仪,包括LC-20AB泵、SPD-20A检测器、N-2000色谱工作站;旋转蒸发器 RE-52A(上海亚荣生化仪器厂);微波提取装置由 KD21B-AN2微波炉 (美的集团有限公司)改装而成,附带冷凝装置;高速万能粉碎机 (FW400A北京科伟永兴仪器有限公司)。

试剂:金银花 (产地:陕西);甲醇 (色谱纯,美国Fisher公司);乙腈 (色谱纯,TED IA公司);水 (娃哈哈纯净水);甲酸 (分析纯,天津市天力化学试剂有限公司);金银花 (产地:陕西)、黄芩 (产地:陕西 )购自当地药店。

1.2样品溶液的制备

准确称取金银花粉末和黄芩粉末各 0.3000g,分别置于两个 100mL圆底烧瓶中,各加入 70%甲醇溶液 30mL,微波提取 5min,提取功率为 400W。分别过滤,取滤液,两种提取液旋转浓缩后,用 70%甲醇溶液定容至 10mL容量瓶中,经 0.22μm滤膜过滤,即得金银花、黄芩提取液。然后,按照中国药典银黄口服液项下比例制备 ,金银花提取液和黄芩提取液按照质量比 1∶2混合,得到混合提取液,以此作为供试品溶液。

1.3一维 HPLC条件

采用 CN柱:LC-20AB岛津高效液相色谱仪;色谱柱为HypersilCN基柱 (250mm×4.6mm i.d.,5μm,大连依利特分析仪器有限公司);流动相:A液为甲醇,B液为 0.1%甲酸水溶液。梯度洗脱:0～10min,10%～20%A;10～20min,20%～40%A;20～30min,40%～45%A;30～40min,45%～50%A。流速为1.0mL/min;检测波长为254nm;进样量:20μL。

采用 C18柱:LC-20AB岛津高效液相色谱仪;色谱柱为 Agilent Eclipse XDB-C18色谱柱 (4.6mm ×250mm,5μm,Unimicro Technologies.Inc.,USA);流动相:A液为乙腈,B液为 0.1%甲酸水溶液。梯度洗脱:0～20min,10%～35%A;20～40min,35%～60%A。检测波长:254nm;流速:1.0mL/min;进样量 20μL。

1.4二维 HPLC条件

第一维:液相色谱条件同 1.3节一维 HPLC条件下 CN柱色谱条件。第二维:液相色谱条件同 1.3节一维 HPLC条件下 C18柱色谱条件。

二维 HPLC操作步骤:供试品溶液按照本节中的第一维色谱条件进行分离,从进样开始每 5min收集一次馏分。重复进样 6次并收集馏分。将相同时间段收集的馏分合并并旋转浓缩,自然风干,用70%甲醇水溶液定量至 0.2mL。然后,进样至第二维 HPLC进行分析。

2结果与讨论

2.1一维色谱分离

图 1和图 2分别为复方银黄口服液在 CN柱和C18柱上的分离效果。从图 1和图 2中可以看出,复方银黄口服液在这两个柱子上,在选定的条件下,组分得到了一定的分离。由于两根柱子不同的分离机理,所得的两张色谱图峰的强度、形状和保留时间都各不相同。从这两个色谱柱的分离效果来看,样品色谱峰在第一维 CN柱的平均峰宽为 1min,理论峰容量为 40,实际分离出 16个峰;样品色谱峰在第二维 C18柱的平均峰宽为 0.5min,理论峰容量为80,实际分离出 20个峰。

图 1银黄口服液在 CN柱上的分离色谱图

图 2银黄口服液在 C18柱上的分离色谱图

2.2二维色谱体系的构建

构建一个二维色谱体系,从理论上来说,第一维和第二维体系应该满足正交性,即这两维体系的分离机理应尽量不同,且第二维的分离不能降低前一维的分辨率[7]。CN柱的极性较强,对极性物质有很好的保留和分离能力;而 C18柱极性较弱,对非极性物质有很好的保留和分离能力;且溶剂甲醇和乙腈对物质的选择性有所不同;所以如果用这两个色谱柱构建一个二维分离体系,有一定的正交性,适合中药复杂体系的分离[8]。由上面一维分离的结果看,其中 C18柱显示了更强大的分离能力,分离效果比 CN柱好。所以,在构建二维分离体系时,将以 CN柱作为第一维,C18柱作为第二维。

2.3二维色谱分离

以 CN柱为第一维,C18柱为第二维,构建了一个二维色谱分离体系,二维峰容量为每一维峰容量的乘积,所以搭建的这个二维分离体系的理论峰容量应为 3200。图 3和图 4分别为收集的每一个馏分在第二维 C18柱上的色谱分离图。从图 4可以看到,至少有 53种成分得到了较好的分离,比一维色谱显著地提高了分离效率。

图 3馏分 1,2,3,4在 C18柱上的分离色谱图

图 4馏分 5,6,7,8在 C18柱上的分离色谱图

3结论

本实验对自制的银黄口服液进行了一维分离和二维分离。结果表明,在一维分离中 CN柱上得到了 16种组分,C18柱上得到了 20种组分。在二维分离中共得到 53种组分,比一维分离中得到了更多的组分。显然,二维液相色谱的峰容量显著高于一维色谱,有利于组分的鉴定;但是,从二维图上看到,二维的分离仍然有些不完全,有些组分还分不开,仍需进行多维分离。

[1] 国家药典委员会.中华人民共和国药典:一部[M].北京:化学工业出版社,2000:580.

[2] GrayM J,Dennis G R,Slonecker P J,et al.J Chromatogr A,2004,1041:101-110.

[3] Giddings J C.Two-dimensional separations concept and promise[J].AnalyticalChemistry,1984,56(12):1258-1270.

[4] 国家药典委员会.中华人民共和国药典:一部[M].北京:化学工业出版社,2000:248.

[5] 中药有效成分提取分离技术.北京:化学工业出版社,2008:103-104.

[6] 刘 雄,高建德.金银花质量控制、化学成分及药理学研究进展[J].甘肃中医学院学报,2006,23(4):46-49.

[7] 国家药典委员会.中华人民共和国药典:一部[M].北京:化学工业出版社,2000:580.

[8] 王智聪,张庆合,张维冰,等.分析化学,2005,33(4):437-441.

[9] Chen X G,KongL,Su X Y,et al.J ChromatogrA,2004,1040:169-178.

TQ028.4

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1003-3467(2010)24-0041-03

2010-12-01

刘文翔 (1984-),女,硕士,电话:15029924348。