-80℃冰冻保存对血小板聚集功能的影响

何丽娟，邓为彬，李永萍

（1.大理学院附属医院，云南大理 671000；2.嘉兴市第二医院，浙江嘉兴 314000）

-80℃冰冻保存对血小板聚集功能的影响

何丽娟1，邓为彬2，李永萍1

（1.大理学院附属医院，云南大理 671000；2.嘉兴市第二医院，浙江嘉兴 314000）

目的：初步了解-80℃冰冻保存对血小板聚集功能的影响。方法：采集健康人新鲜血进行离心，制作富含血小板的血浆（PRP），用血小板聚集仪检测聚集功能；将分离的血小板分别加入保护剂5%二甲基亚砜（5%DMSO）后迅速置于-80℃低温冰箱保存1月，复苏后再次对血小板聚集功能进行检测。结果：血小板聚集率和聚集率单位时间的变化冰冻前后对比均无统计学意义（P＞0.05）。结论：血小板加终浓度为5%DMSO，在-80℃条件下冰冻保存1个月，血小板的聚集功能稳定。

血小板；冰冻保存；聚集功能

聚集功能是评价血小板体外功能的重要指标，也是血小板的一个重要生理特性，同时是其参与止血和血栓形成过程的重要因素之一。本实验尝试国际普遍使用的生物冷冻保护剂二甲基亚砜（DMSO）对人工分离浓缩血小板进行深低温（-80℃）保存，并对解冻后的血小板进行聚集功能检测，以期为临床用血提供实验依据。现将研究结果报告如下。

1 材料与方法

1.1 研究对象 采集12名健康志愿者的血液，献血者均是某大学在校大学生，年龄21～26岁，男女各6人，其中2名为外国留学生，符合我国献血体检标准。在献血前1 d内未饮用过含酒精类饮料，2周内未服用过阿司匹林及其他抗血小板及抗凝血的任何相关药物，未检测到出、凝血性疾病。血细胞比容≥0.36，外周血Plt＞150×109/L。将所采集的10 m L/人（份）全血共12份，抗凝剂枸橼酸钠（ACD）与全血比为1∶9，置于室温（20℃左右）进行样本处理。

1.2 主要实验试剂及仪器 ①二磷酸腺苷（ADP）试剂（购于美国Helenna公司）；②DMSO（天津化学试剂有限公司；③-80℃冰箱（Forma，美国）；④APACT4血小板聚集仪（德国）。

1.3 方法

1.3.1 静脉取血 健康志愿者空腹抽取静脉血置于抗凝液的离心管中1∶10体积（1mL枸橼酸钠+9mL静脉血），抽血完后轻轻震荡摇匀，室温为20~24℃。

1.3.2 富血小板血浆（platelet rich plasma，PRP）的制备 将上述的采血离心管在天平上调至平衡（每次离心均需要配平）两侧对称放入离心机中，经500r/min离心11 min，轻轻取上层黄色清亮液体即制备出新鲜富含血小板血浆（FPRP）。

1.3.3 贫血小板血浆（platelet poor plasma，PPP）的制备 取上层液PRP剩下血浆高速离心（4 000 r/min离心20min），轻轻取上层黄色清亮液体即制备出新鲜贫血小板血浆（FPPP）。

1.3.4 血小板的保存 留取一半新鲜的PRP和PPP进行血小板相关测定，剩下的一半在洁净的环境中采用严格的无菌技术缓慢加入生物冷冻保护剂DMSO到冰冻管里至终浓度为（5.0±0.5）%，然后用湿棉布包冰冻管置-80℃冰箱保存，每冰冻管产品留样量4～5mL冻存，冰冻管予拧紧管盖密封保存。1个月后，取出冰冻制品在恒温水浴箱里（温度37～40℃）快速解冻，轻轻摇动至融化。

1.3.5 血小板聚集功能的测定 以ADP为诱导剂采用比浊法测定（严格按照APACT4血小板聚集仪操作说明）。

1.4 统计学处理 各组资料统计分析采用配对资料t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。所有资料均使用SPSS11.5统计软件包进行统计分析。

2 结果

新鲜血小板和-80℃冰冻保存1个月血小板最大聚集率（Aggregation）和聚集斜度时间变化率（Slope）差异均无统计学意义（P＞0.05）。见表1及图1、2、3。

表1 -80℃冰冻保存前后血小板聚集功能的变化/%

图1 血小板冰冻前后A ggregation的对比

图2 血小板冰冻前后S lope的对比

图3 冰冻前后血小板聚集率的比较

B.冰冻后聚集率

3 讨论

聚集作用是血小板的重要生物功能之一，长期以来血小板聚集活性的检测一直是血小板体外功能评价的金标准。目前认为，血小板活化聚集主要通过3条途径：花生四烯酸（AA）途径、ADP途径和血小板活化因子（PAF）途径〔1〕。AA、ADP、PAF通过不同的机制诱导血小板聚集。20世纪60年代，Born〔2〕首先采用了比浊法测定血小板聚集率。比浊法检测血小板聚集是近几十年来在临床和研究中最常用的方法，利用血小板聚集仪能够比较方便、快速地获得血小板聚集情况来评价血小板的聚集功能。其不足之处是离心等步骤容易导致血小板体外激活。

血小板在22℃恒温条件下，用振荡或旋转式保存的时间仅为5 d，不仅大大限制了血小板的应用，而且其保存的温湿度条件也正是细菌繁殖的最适条件，易发生污染甚至导致严重的输注事故发生〔3-4〕。多年来许多学者致力于寻找一种能有效保存血小板的方法。大量的研究表明深低温保存可降低血小板代谢，抑止细菌生长，既延长了保存时间，又减少了细菌污染。为长期保存血小板提供了帮助〔5〕。深低温保存血小板所带来的一个问题是冻存和复温过程中，由于冰晶的形成与生长、冰晶的再结晶、高渗压力和溶质的高浓度毒性等有害因素，使血小板遭到不可逆的损伤而死亡。因此，深低温保存血小板的过程中必须使用冷冻保护剂（CPA）。由于DNSO有细胞毒性低、分子量小、强渗透性、易于穿透细胞、可使冰点下降、提高胞膜对水的通透性、减少细胞内冰晶形成等诸多优势〔6〕，使其成为血小板冰冻保存的首选，目前研究中也多选用5%～6%的DMSO作为CPS〔7-9〕。

赖东生等〔10〕报道DMSO终浓度达到制备冰冻血小板要求的5%时，聚集功能的抵制显著，其聚集的强度接近零。国内孔令魁等〔11〕观察到22℃保存的液体血小板随保存时间的延长其聚集功能逐渐下降，且下降进程呈加快的趋势，推测新鲜血小板在常温保存期间可能发生代谢损伤。而对5%DMSO和-80℃条件下的冻存血小板进行了长达5年的跟踪观察，其体外聚集功能并没有发生显著改变。我们的研究也观察到采用终浓度5%的DMSO，在-80℃条件下保存1月，冰冻前后血小板的聚集率和聚集时间变化率都较为稳定，最大聚集率（PAG）有轻微下降，而聚集斜度（S lope）变化不大，部分时间段里冰冻血小板的聚集斜度更大，特别是血小板聚集的中前期。综上所述，深低温加终浓度5%DMSO冻存血小板可以有效抑制血小板在常温保存过程中的代谢损伤，冻存过程中所有潜在的致血小板活化步骤或因素并没有明显影响到血小板的聚集功能。

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〔9〕刘景汉，欧阳锡林，庄远，等.-80℃长期保存血小板的可行性研究〔J〕.中国输血杂志，2008，21（4）：243-245.

〔10〕赖东生，陈岑.二甲基亚砜（DMSO）对血小板体外聚集功能的影响〔J〕.中国输血杂志，2004，17（6）：446.

〔11〕孔令魁，朱为刚，熊文，等.机采浓血小板-80℃长期冻存的动态的体外粘附、聚集功能和Ⅲ因子活性变化〔J〕第三军医大学学报，2006，28（17）：1898-1800.

（责任编辑 张 焕）

Effect of the Platelet Aggregation Function after Cryopreservation at-80℃

HE Lijuan1，DENGWeibin2，LIYongping1
（1.Affiliated Hospital of DaliUniversity,Dali,Yunnan 671000，China;2.The Second Hospital of Jiaxing,Jiaxing,Zhejiang 314000,China）

Objective:A preliminary study of the effect of platelet aggregation function cryopreservation at-80℃.MethodsFresh blood were obtained from the health donors,platelet-rich plasma （PRP）were prepared after centrifugation.Platelet aggregation was measured by platelet aggregationmachine.Then,the platelet samples were cold preserved at-80℃after added with protective agent DMSO （5%DMSO）.One month later,the platelet aggregation was measured again after rapid recovery.ResultsThe platelet aggregation rate（PAG）and the change of aggregation rate per unit time are not statistically significant difference（P>0.05）before and after the cold preservation.ConclusionAfter cold preservation under the condition of 5%DMSO,-80℃for 1 month,platelet aggregation function retained stability.

platelet;cryopreservation;aggregation function

R457

A

1672-2345（2010）12-0035-03

大理学院科研基金资助项目（2007X11）

2010-10-28

何丽娟，主治医师，主要从事血液病学研究.

*通信作者：李永萍，教授，电话：13608829819.