NGX6和CyclinD1蛋白在食管鳞癌组织中的表达及意义

王国磊 蒋庆峰 张瑞祥 申思宁 李印

河南省肿瘤医院胸外科，郑州大学附属肿瘤医院，河南 郑州 450008

肿瘤分子生物学研究表明，几乎所有的癌基因、抑癌基因通过直接或者间接的作用最终都会导致细胞周期的异常，使肿瘤细胞呈失控性生长。鼻咽癌相关基因6(nasopharyngeal carcinoma-associated gene 6，NGX6)是近年来发现的一种新的肿瘤抑癌基因［1］，能够抑制多种肿瘤细胞的增殖，而转染NGX6基因的HNE1细胞能够延长裸鼠的成瘤时间。NGX6基因在结直肠癌、胃癌组织和体外培养的鼻咽癌细胞等恶性肿瘤中表达下调，并与肿瘤的增殖和转移密切相关［2-3］。细胞周期素D1(CyclinD1)是细胞周期的正调节因子，CyclinD1蛋白过表达可以加速细胞G1期向S期转化，促使细胞增殖。研究发现，CyclinD1在乳腺癌、肺癌等多种肿瘤中过表达，并且过表达患者的生存率明显低于低表达者，提示其可作为判断肿瘤预后的重要指标［4-5］。本研究检测食管鳞癌组织、癌旁不典型增生组织和正常食管黏膜组织中NGX6和CyclinD1蛋白的表达，以探讨NGX6和CyclinD1蛋白异常表达与食管鳞癌发生的关系及其临床意义，并分析两种蛋白表达的相关性。

1 资料和方法

1.1 研究对象

60例组织标本系河南省肿瘤医院2006年8月—2009年3月食管癌新鲜手术切除标本，病理证实均为鳞癌，并取相应的癌旁不典型增生标本30例及正常食管黏膜标本20例。癌旁不典型增生组织取自距癌组织边缘3 cm以内的组织，正常组织取自手术残端，距癌组织3 cm以上。其中男性33例，女性27例，年龄40～78岁，平均(60.6±16.3)岁，术前均未行放疗及化疗。食管癌组织学分级：高中分化35例，低分化25例。按UICC(1997)TNM分期，Ⅰ～Ⅱ期32例，Ⅲ～Ⅳ期28例。浸润深度：浅肌层16例，深肌层20例及外膜组24例。有淋巴结转移26例，无淋巴结转移34例。

1.2 试剂

兔抗人NGX6多克隆抗体购于武汉博士德生物工程公司；即用型兔抗人CyclinD1单克隆抗体、SP试剂盒及DAB显色试剂盒均购自北京中杉有限公司。

1.3 研究方法

实验方法参照免疫组化SP试剂盒说明书进行操作，用已知的阳性对照片作为阳性对照，以PBS代替一抗作阴性对照。

1.4 结果判定

以肿瘤细胞或者正常细胞的细胞质和细胞膜内出现棕黄色颗粒为NGX6阳性细胞；以肿瘤细胞胞核内出现棕黄色颗粒为CyclinD1阳性细胞。在显微镜400倍视野下随机选取5个有代表性的不同区域，每个视野的得分由阳性细胞的比例和显色强度两方面决定。阳性细胞比例为盲观测计数200个肿瘤细胞中阳性染色细胞的比例。记分标准：<5%记分为0，5%～25%记分为1，26%～50%记分为2，51%～75%记分为3，>75%记分为4。着色强度：不着色记分为0，淡黄色为1，棕黄色为2，棕褐色为3,然后根据两者乘积的积分进行统计学处理。依据评分判断染色结果：评分0～1为(-)，2～4为(+)，5～7为(++)，≥8为(+++)［6］。

1.5 随访

60例食管癌患者中47例有1年以上的随访资料，失访13例；随访3年以上38例，存活12例，因肿瘤复发、广泛转移死亡26例。分别取癌组织、癌旁不典型增生组织及正常组织固定于4%的多聚甲醛中，然后石蜡包埋，用于免疫组化检测。

1.6 统计学处理

所有数据均采用SPSS 11.0统计学软件进行统计学处理，阳性率之间的比较采用χ2检验，两变量之间的关系分析采用Spearman等级相关分析表示，检验标准以α=0.05为显著性检验水准，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 食管鳞癌组织、癌旁不典型增生组织和正常食管黏膜组织中NGX6和CyclinD1蛋白表达

所有标本均成功进行了两种蛋白的检测，统计学处理显示，食管鳞癌组织中NGX6蛋白阳性表达率明显低于正常食管黏膜组织(P<0.05)；食管鳞癌组织中CyclinD1蛋白阳性表达率明显高于癌旁不典型增生组织及正常食管黏膜组织(P<0.05，表1)。如图1所示，食管组织中NGX6和CyclinD1 阳性表达。

表1 食管鳞癌组织、癌旁不典型增生组织及正常食管黏膜组织中NGX6和CyclinD1蛋白表达Tab.1 The expression of NGX6 and CyclinD1 in esophageal squamous cell carcinoma tissues, paracancerous tissues and normal esophageal epithelial tissues(n)

2.2 NGX6和CyclinD1蛋白表达与食管鳞癌临床病理特征的关系

NGX6和CyclinD1蛋白表达分别与食管鳞癌临床分期、浸润深度及淋巴结转移有关(P均<0.05)；而与患者性别、年龄及病理分级无关(P>0.05；表2、3)。

2.3 NGX6和CyclinD1蛋白在食管鳞癌中表达的关系

NGX6和CyclinD1蛋白在食管鳞癌组织中的表达呈明显的负相关 (P<0.05，表4)。

表2 NGX6蛋白表达与食管鳞癌临床病理特征的关系Tab.2 The relationship between NGX6 expression and the clinicopathological features of esophageal squamous cell c arcinoma(n)

表3 CyclinD1蛋白表达与食管鳞癌临床病理特征的关系Tab. 3 Correlations of CyclinD1 expression to clinicopathologic features of esophageal squamous cell carcinoma(n)

表4 NGX6蛋白与CyclinD1蛋白在食管鳞癌中表达的关系Tab.4 The relationship between the expression of NGX6 and CyclinD 1 in the esophageal squamous cell carcinoma tissues(n)

3 讨 论

NGX6是新近克隆的候选抑癌基因，位于染色体9p21-22，而该区域的等位基因杂合性缺失现象是多种肿瘤的共同事件［7-8］。NGX6基因由10个外显子组成，cDNA全长2 134 bp，编码一种含有338个氨基酸的跨膜蛋白质［9］。通过对转染NGX6的人结肠癌细胞HT-29的生物学性状的研究，Wang等［10］发现NGX6高表达能延缓HT-29细胞周期由G0/G1期至S期的进程，并能抑制裸鼠成瘤。有研究表明，NGX6基因在人结肠癌组织中表达下调，且伴有在转移的结肠癌组织中表达下调率明显高于无转移的结肠癌组织的现象，提示NGX6通过低表达或者表达缺失参与结肠癌的增殖和转移过程［11］。本实验结果显示，NGX6在由正常食管黏膜组织、癌旁不典型增生组织到食管鳞癌组织的演变过程中，其蛋白阳性表达率依次降低，三者之间差异有统计学意义(P<0.05)。提示NGX6蛋白的低表达及表达缺失可能成为食管鳞癌发生的早期标志，对于食管鳞癌的早期诊断有一定的临床意义。进一步研究显示，NGX6蛋白表达与食管鳞癌临床分期、肿瘤浸润、转移有关，而与患者性别、年龄及病理分级无关。提示NGX6失活可能参与了食管鳞癌的局部浸润和远处转移的过程。

CyclinD1是细胞周期素家族中最重要的成员，定位于人染色体11q13，由5个外显子组成，编码295个氨基酸组成的蛋白质，是细胞周期的正性调控因子。CyclinD1高表达可激活CDK4，使抑癌基因表达产物Rb蛋白失去对细胞周期的制动功能，促使细胞由G1期向S期演进。CyclinD1在正常组织中表达很少或者不表达，而在肝癌、肺癌、前列腺癌及乳腺癌等多种肿瘤中存在过表达，并成为评估肿瘤进展及预后的重要指标之一［12］。本实验结果与上述研究结果一致。食管鳞癌组织中CyclinD1蛋白阳性表达率高于癌旁不典型增生组织及正常食管黏膜组织，差异有统计学意义；进一步研究显示，CyclinD1表达与食管癌临床分期和肿瘤转移有关。这可能由于CyclinD1蛋白过表达使正常食管黏膜细胞周期异常，从而导致正常细胞的恶性转化及食管鳞癌的浸润转移。另外，本研究还观察了NGX6和CyclinD1蛋白在食管鳞癌组织中表达的相关性，发现NGX6和CyclinD1蛋白的阳性表达呈显著负相关。表明两者可能在食管鳞癌的发生和浸润转移过程中起着一定程度的协同作用。研究证实，NGX6可下调结肠癌细胞HT-29中JNK/SAPK通路中的重要激活蛋白MADD(MAP-kinase activating death domain)表达的3倍以上，并可降低EGFR和CyclinD1的表达，抑制结肠癌细胞周期由G0/G1到S期的转化［13］。由此我们推测NGX6表达缺失可能增强CyclinD1信号传导通路的活性，使细胞周期发生改变，正常细胞的生长失控、异常增殖，最终导致肿瘤的发生。两者联合检测对于阐明食管鳞癌的发生发展机制以及肿瘤的早期诊断和预后评估具有重要的临床意义。

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