应用MALDI-TOFMS技术建立贲门癌血清蛋白指纹图谱诊断模型

孟君 刘丽华 单保恩 艾军 张超 张璁 韩丽娜

河北医科大学第四医院科研中心，河北省肿瘤研究所，河北 石家庄 050011

贲门癌是常见的消化道恶性肿瘤，近年来其发病率呈上升趋势［1-3］。贲门癌显著的流行病学特征是与食管癌高发区地域性分布的一致性［4-5］，河南、河北、山西交界的太行山一带的农村是世界上食管癌和贲门癌发病率和病死率最高的地区［6-7］。贲门癌具有分期晚、转移早、分化程度低等特点，内镜和上消化道造影是主要诊断方法，但痛苦大、费用高、患者依从性差。因此，寻找有效的肿瘤标志物用于贲门癌高危人群的“早发现、早诊断、早治疗”，对于提高患者的生存率，延长生存时间具有重要意义。

近年来，蛋白质组学的迅速发展推进了肿瘤标志物发现的进程。在过去10年中，基质辅助激光解析离子化飞行时间质谱(matrix assisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometry, MALDI-TOF MS)已经成为肿瘤学研究中广泛应用的蛋白质组学工具［8-9］。这项技术的高通量、微上样量、适合大样本检测等特点使其成为发现和验证血液等体液中肿瘤标志物的新技术平台。本研究应用MALDI-TOF MS技术对贲门癌患者及健康对照组血清进行检测，建立贲门癌血清蛋白诊断模型，探讨其临床应用价值。

1 对象和方法

1.1 研究对象

收集2009年3月—2010年5月就诊于河北医科大学第四医院胸外科的贲门癌患者血清标本共63例(贲门癌组)，其中男性56例、女性7例，年龄41～78岁，平均(63.8±8.4)岁，所有标本均经病理证实为贲门腺癌，均未接受治疗。健康对照组血清54例，来自于健康体检者，其中男性43例、女性11例，年龄52～77岁，平均(65.4±6.5)岁。两组间年龄、性别比较差异无统计学意义(P>0.05)。所有研究对象都签署知情同意书，并报医院伦理委员会批审同意。空腹状态下采集静脉血，分离血清标本，严格按照ClinProt标准化方案处理，4 ℃静置1 h后以2 000 r/min(r=0.1 m)离心5 min，取血清再次以10 000 r/min(r=0.06 m)离心10 min，分装后-80 ℃保存。保证实验标本仅冻融1次，减少小分子蛋白或多肽的损失。

1.2 主要仪器和试剂

乙腈(CHCA)、Clinprot弱阳离子螯合磁珠(MB-WCX)试剂盒、多肽及蛋白标准品购自德国Bruker Daltionics公司，三氟乙酸购自美国Alfa Aesar公司。其他试剂均购自美国Sigma公司。AtuoflexⅢ型质谱仪为德国Bruker Daltonics公司产品。

1.3 血清蛋白制备

血清标本冰浴解冻，4 ℃、10 000 r/min(r=0.06 m)离心10 min。取5 μL样品加入已装好10 μL结合缓冲液(binding solution，BS)和10 μL WCX磁珠悬浊液的样品管中，充分混匀后置于磁珠分离器上静置5 min；小心吸去悬浮液体，加入磁珠清洗液(washing solution，WS)，在磁珠分离器前后两孔间反复移动样品管10次，重复清洗3次；以5 μL磁珠洗脱缓冲液(elution solution，ES)洗脱磁珠结合的蛋白，置于新样品管中，加入5 μL稳定缓冲液(stable solution，SS)吸打混匀后即可用于后续质谱分析。

将1 μL制备好的蛋白样本随即点样于384普通靶(Bruker Daltonics公司)上后，每个样品点加1 μL基质(3 mg/mL CHCA，50%ACN，2%TFA)，进行MALDI-TOF MS 分析。采用标准品进行相对分子质量校正。以标准血清对整个实验流程进行质量控制，每7个样本与1个标准血清匹配，并同时进行实验。

1.4 质谱仪参数设置及数据采集

MALDI-TOF质谱仪(Autoflex Ⅲ型)数据采集方法应用ClinProt线性阳离子模式，参数设置如下：第一离子源20.0 kV；第二离子源18.4 kV；以25 Hz氮激光照射激发电离。经标准品优化后的数据收集相对分子质量范围为(1～15)×103。每例制备好的血清标本在靶上重复4个点，同一靶点的不同结晶点进行多点采集，每个点采集200 shots，选10个不同位置累计2 000 shots。为了增加检测敏感性，我们先以38%的激光强度轰击，之后换用24%的激光强度采集图谱。

1.5 生物信息学分析

本实验采用浙江大学肿瘤研究所设计的ZUCI-蛋白芯片数据分析系统(ZUCI-Protein Chip Data Analyze System，ZUCI-PCDAS)进行数据分析。对采集图谱进行均一化处理，去噪平滑，过滤信噪比<2的蛋白峰，对每个蛋白质荷比峰做Wilconxon 秩和检验，筛选出有差异的质荷比峰。通过遗传算法结合支持向量机运算建立贲门癌血清蛋白指纹图谱模型，以留一法进行交叉验证。所有样本随机划分，2/3样本作为训练组，1/3样本作为盲法测试组，并将训练组样本再随机划分出1/3进行交叉验证，经软件包运算后计算每个样本的平均预测值，并计算灵敏度和特异度。

1.6 统计学处理

对初步筛选出的蛋白质荷比峰进行t检验，偏态分布数据用Mann-Whitney检验，实验结果用均数±标准差(±s )表示，P<0.01为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 MALDI-TOF质谱仪数据采集的重复性分析

在MALDI-TOF质谱仪数据采集中，实验质量控制的标准品校正平均相对分子质量偏差<0.01%。作为实验流程质量控制的标准血清质谱图采集后，与数据库中已有的对应WCX磁珠相同采集方法的标准血清数据比较，变异系数(CV)<30%。

2.2 贲门癌组和健康对照组血清差异蛋白质荷比峰的筛选

贲门癌患者和健康对照组的血清样本分别经WCX磁珠处理后，用Autoflex Ⅲ型质谱仪检测，在相对分子质量(1～15)×103范围内，共检测到149个蛋白质荷比峰，其中69个差异有统计学意义(P<0.01)。P值越小，说明在两组中差异越显著，单个质荷比峰的分组能力越强。

2.3 贲门癌蛋白指纹图谱诊断模型的建立及验证

利用ZUCI-PCDAS蛋白质数据分析软件包，通过GA结合SVM运算，最终筛选出10个差异最显著的蛋白质荷比峰建立诊断模型(表1)。与正常对照组比较，其中m/z为2 863、3 241、2 295和2 671 的4个蛋白峰在贲门癌组中高表达；而m/z为4 655、3 883、3 952、2 741、1 546和4 054的6个蛋白峰在贲门癌组中低表达。图1、2显示的是m/z为2 836和3 952的2个蛋白峰在两组中的表达情况。该模型能够很好的区分贲门癌组和健康对照组(图3)。

以留一法进行交叉验证评估诊断模型的判别效果。将所有血清样本随机分为训练组和盲法测试组，表2显示的是两组的样本分布情况。经盲法交叉测试，21例贲门癌患者中有20例被准确检出为贲门癌，18例健康志愿者中有16例被确定为健康者。结果表明，该诊断模型的灵敏度为96.83%，特异度为90.74%，阳性预测值为92.42%。

表1 贲门癌患者与健康对照组中10个差异蛋白质荷比峰的比较Tab.1 Comparison of 10 differential protein m/z peaks between GCA patients and healthy controls

表2 训练组和盲法测试组样本分布情况Tab.2 Study population used in training set and validation set

3 讨 论

贲门癌与食管癌高发区地域性分布一致是显著的流行病学特征［4-5］。然而近年来对高发现场进行筛查发现，内镜下碘染色指导活检技术对食管鳞状上皮早期癌及癌前病变具有良好的检出能力，但对贲门癌及癌前病变的检出尚不理想，限制了高发区早诊断早治疗的整体效果。贲门癌的另一显著流行病学特征是与胃远侧部位肿瘤的不一致性［10］。在过去的几十年里，世界上很多国家和地区的胃癌发生率明显下降［11-12］，而贲门癌的发生率却呈上升趋势［13-14］。在中国北方地区，90%的城市居民及95%的农村居民贲门癌首次被确诊时已属于中、晚期［15］。贲门癌预后差，5年生存率仅为28.5%［16］。对高危人群进行定期检查，做到早发现、早诊断、早治疗，可以提高患者的生存率、延长生存时间。因此，寻找敏感、特异的肿瘤标志物，是提高贲门癌早期诊断率和降低死亡率的重要手段，对于贲门癌的基础和临床研究也具有非常重要的意义。

近年来，蛋白组学研究发展迅速，尤其在肿瘤标志物检测方面显示出特有的高灵敏度、高特异度等优点。这一领域的相关技术可以对多种临床标本进行检测，包括血液、脑脊液、唾液和尿液等。血液中含有正常和癌组织释放的蛋白和肽段［17］，标本获取简便，对人体损伤小且适合长期的检测观察，因而得到广泛的应用。血液标本收集和处理的标准化问题也是应用蛋白质组学方法发现肿瘤标志物的关键环节。Timms等［18］研究了收集血液的容器、凝血时间、运送时间、温度和储存方法的不同对血液中蛋白及多肽的影响，并建立了用于蛋白质组学研究的标准化样本处理流程。他们指出：严格按照标准化流程进行血液样本的收集处理，对于蛋白质组学研究至关重要。冻融次数是否对血液标本有影响存在一些争议，一部分学者认为，冻融数次对于血液蛋白指纹图谱的影响是微乎其微的［19］；而大多数的学者认为，血液反复冻融后成分会发生变化，其原因可能与肽的聚合、沉淀、表面吸附等一系列变化有关，因此要尽量避免血液标本的反复冻融［20］。

本实验在血液标本的收集和处理过程中，严格按照ClinProt标准化流程，规范从临床采集、运送、处理以及存储各个环节，最大程度上避免人为因素对标本中蛋白含量的影响；同时我们采用标准品进行相对分子质量校正，以标准血清对整个实验流程进行质量控制；在数据采集方面，每例制备好的血清标本在靶上重复4个点，对同一靶点的不同结晶点进行多点采集。以上的分析前处理保证了实验的可重复性，测得实验质量控制的标准品校正平均相对分子质量偏差<0.01%。作为实验流程质量控制的标准血清质谱图采集后，与数据库中已有的对应WCX磁珠相同采集方法的标准血清数据比较，CV<30%。说明严格执行标准化作业流程得到的实验重复性较好。

MALDI-TOF MS技术是广泛应用的蛋白质组学技术之一，且在血液肿瘤标志物研究领域具有更大的优势［21］。现在的研究致力于发现差异表达的一组蛋白或肽段并构建基于多种特征的诊断模型［22］，从而避免用单一肿瘤标志物或数个肿瘤标志物的简单叠加检测而产生的灵敏度和特异度的矛盾。MALDI-TOF MS方法能够识别鉴定细胞、组织或机体的全部蛋白质，提供一组蛋白质的功能及其模式的信息，为较整体的检测提供了可能。Schwamborn等［23］以磁珠处理105例膀胱癌患者、98例健康人群及45例前列腺癌患者血清标本后，用MALDI-TOF MS的方法检测其蛋白指纹图谱并建立膀胱癌诊断模型，该模型灵敏度和特异度分别为94.1%、86.5%；其中早期贲门癌的检出率达到96%。Liu等［25］应用MALDI的ClinProt方法和磁珠分选技术检测食管鳞状细胞癌患者及健康志愿者血清标本，数据分析后选择11个蛋白峰建立诊断模型，其中4个蛋白高表达于食管鳞癌组，7个蛋白呈低表达。联合检测结果表明，其诊断灵敏度为90.0%，特异度为84.0%，阳性预测值为88.0%，阴性预测值为80.0%，为食管癌早期诊断提供了新的思路。

本研究利用MALDI-TOF MS技术检测贲门癌与健康对照组血清蛋白质指纹图谱，ZUCIPCDAS软件包对所得数据进行分析，采用支持向量机方法建立判别模型，留一法交叉验证判定模型效果，经过大量生物信息学分析和统计学处理，最终筛选出正确诊断指数最高的10个蛋白质荷比峰组合建立诊断模型，确保了诊断模型的准确性与严谨性，优于以往建模方案。本组贲门癌蛋白指纹图诊断模型灵敏度96.83%，特异度90.74%，阳性预测值92.42%，能够很好地将贲门癌患者和健康对照组进行诊断区分，为贲门癌的诊断提供了新的思路和选择。如果能够继续扩大样本量，提高盲法验证实验的重复性与可靠性，并对诊断模型中的差异蛋白质荷比峰进行分离、纯化鉴定，将会进一步增加该模型临床应用的可行性，同时也为筛选贲门癌新的肿瘤标志物奠定基础。

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