声动力化学疗法促大鼠脑胶质瘤细胞凋亡及抗血管作用的实验研究

2010-09-20宋大勇林述凯李建华

中风与神经疾病杂志 2010年12期

宋大勇, 岳武, 魏盾, 林述凯, 孙超, 李建华

声动力化学疗法(sonodynamic therpy,SDT)可引起体外大鼠 C6胶质瘤细胞凋亡[1],为进一步观察 SDT对大鼠脑胶质瘤细胞凋亡的影响及是否有抗血管因素参与,我们以大鼠颅内 C6胶质瘤为模型,研究了 SDT处理后大鼠脑胶质瘤的细胞凋亡与微血管蛋白表达的变化。

1 资料与方法

1.1 材料与试剂大鼠 C6胶质瘤细胞(哈尔滨医科大学神经外科研究所)、Wistar大鼠(哈尔滨医科大学附属第一医院实验动物中心)、HMME(北京英发康美技术开发有限公司)、胎牛血清(天津 TBD公司)、RPMI-1640培养液 (美国 Hylone公司)、胰蛋白酶(美国 AMRESCO公司)、TUNEL凋亡检测试剂盒(宝灵曼公司)、兔抗鼠 VEGF、CD34免疫组化试剂盒(武汉博士德生物工程有限公司)、山羊抗兔IgG免疫组化试剂盒(北京中杉金桥生物制品有限公司)、SABC试剂盒通用型(Zymed公司)、DAB显色剂(北京中杉金桥生物制品有限公司)。

1.2 仪器 US天使多功能治疗仪(天使科技控股有限公司)、大鼠脑立体定向仪(上海江湾Ⅱ型)、MIR机(日本东芝公司 1.5TVISRT型)、倒置相差显微镜(日本 OLYMPUS公司 IX70型)、CO2培养箱(上海 Heraeus公司 BB5060型)、洁净操作台(上海力申科学仪器有限公司 H fsate1200型)、离心机(上海安亭科学仪器厂 80-2B型)。

1.3 方法

1.3.1 C6胶质瘤细胞培养 C6胶质瘤细胞接种于含 10%胎牛血清的 RPMI-1640完全培养液25ml培养瓶中,将培养瓶置于 37℃、5%CO2和 95%空气的培养箱中常规培养,待细胞处于对数生长期时实验。

1.3.2 大鼠 C6脑胶质瘤模型的制作 Wistar大鼠(雄性,体重 250～350g)96只。术前 12h禁食、禁水,1%戊巴比妥钠按 40mg/kg腹腔注射麻醉后,固定于江湾Ⅱ型立体定向仪上,常规方法制作大鼠颅内 C6脑胶质瘤模型[2]。术后连续 3d注射青霉素 4万 U/d,常规饲养。

1.3.3 实验分组大鼠接种 C6胶质瘤术后14d,经 MIR扫描,待肿瘤直径达 3～5mm随机分成4组：(A)SDT组,即 US加 HMME组;(B)单纯超声(US)组;(C)单用血啉甲醚(HMME)组;(D)未处理的对照组。每组 24只。

1.3.4 SDT处理 1%戊巴比妥钠麻醉(40mg/kg)后,A、C组大鼠尾静脉注射 HMME(10mg/kg),2h后 A、B组行 US照射(频率：1.0mHz,声强度：0.5W/cm2,时间：120s)。处理后的大鼠避光 7d,常规饲养。

1.4 观察指标

1.4.1 一般状态切口愈合情况、活动能力、体重变化、有无偏瘫、抽搐等神经功能缺失症状。

1.4.2 原位细胞凋亡检测 4组大鼠处理后24h、3d,7d分别随机处死 8只,开颅取出肿瘤组织。标本常规固定、包埋、切片。TUNNEL法检测细胞凋亡情况,方法按照 Roche公司原位细胞凋亡检测试剂盒说明书进行操作,常规封片,显微镜下观察。以核阳性为判定标准,并结合 HE染色 40倍显微镜下观察,对 HE染色证实为坏死的细胞不记数。细胞核内有棕褐色染色者为阳性细胞,400倍显微镜下每张切片随机选择 5个视野,两人双盲计数 500个细胞中的阳性细胞数,取均值。排除有严重的炎症反应和坏死灶的区域,因为这给单个凋亡细胞的鉴别带来困难。计算凋亡细胞百分率：凋亡细胞百分率(%)=阳性细胞数/(阳性细胞数+阴性细胞数)×100%。

1.4.3 VEGF蛋白、CD34蛋白表达水平观察4组大鼠治疗 24h、3d、7d后,分别随机处死 8只,开颅取出肿瘤组织。标本常规固定、包埋、切片。标本免疫组织化学染色采用 SABC法,按说明书进行操作。因 CD34蛋白主要表达于血管内皮细胞,在间质和癌巢都有分布,MV形态表现为管状、线状和点状,以一个或一组内皮细胞标记为一条血管,故通过测定 CD34蛋白表达可判定 MVD结果：先在 40倍光镜下扫视肿瘤区域,选择血管丰富的区域,转400倍显微镜下观察,随机选择 5个视野,记数被抗CD34抗体染成棕色的 MV数目,取均值作为该例的MVD值。VEGF蛋白表达结果判定：先在 40倍光镜下扫视肿瘤区域,选择 VEGF蛋白表达较强的区域,400倍显微镜下观察,随机选择 5个视野,两人双盲计数 500个细胞中的阳性细胞数(细胞胞浆内棕褐色染色),取均值。VEGF蛋白表达率计算公式同前。对 4组各时间点 MVD值、VEGF蛋白表达分别与凋亡率计算 r值。

2 结果

2.1 一般状态在实验过程中因操作不慎死亡或肿瘤失败的大鼠予以重新补充。大鼠接种后均无感染,从接种后第 3天开始,部分大鼠逐渐出现消瘦、肢活动不灵活、抽搐、易激惹等表现,濒死前 4组均表现频发抽搐、极度消瘦、恶液质等症状。

2.2 原位细胞凋亡检测结果检测结果(见表1,见图1、图2)。HMME组和对照组凋亡细胞极少,各时间点凋亡率比较,无统计学意义。切片均未见明显坏死细胞,偶见凋亡细胞。US组处理后 24h,切片可见小片状坏死区和散在分布的坏死细胞,凋亡细胞散在分布,凋亡率高于 HMME组和对照组,有统计学意义;处理后 3d切片可见散在坏死细胞,偶见凋亡细胞,凋亡率较处理后 24h下降,与 HMME组和对照组比较,无统计学意义;处理后 7d,切片未见明显坏死细胞,偶见凋亡细胞,凋亡率与 HMME组和对照组比较,无统计学意义。SDT组处理后24h,切片可见明显片状坏死区或坏死细胞,凋亡细胞多分布于片状坏死区周边,或与坏死细胞夹杂,凋亡率明显高于其它 3组,有统计学意义;处理后 3d,切片见片状坏死区明显缩小、坏死细胞数量明显减少,凋亡细胞少见,但凋亡率与其它 3组比较,仍有统计学意义;处理后 7d,切片未见坏死细胞,凋亡细胞偶见,凋亡率与其它 3组比较,无统计学意义。

2.3 MVD、VEGF蛋白表达结果结果(见表2、表3,见图3～图6)。HMME组和对照组各时间点MVD、VEGF蛋白表达比较,无统计学意义。2项染色在瘤组织内分布不均匀,瘤组织与正常脑组织交界区表达相对较强。切片均未见明显坏死细胞。US组处理后 24h,MVD、VEGF蛋白表达与 HMME组和对照组比较,略下降,无统计学意义,切片可见小片状坏死区和散在分布的坏死细胞;处理后 3d,2项表达结果与HMME组和对照组类似,无统计学意义,切片可见散在坏死细胞;处理后 7d,2项表达结果与 HMME组和对照组类似,无统计学意义,切片未见明显坏死细胞。SDT组处理后 24h MVD、VEGF蛋白表达与其它3组比较,明显下降,有统计学差异,切片可见明显片状坏死区或坏死细胞;处理后 3d,二者表达有所升高,但仍较其它3组低,与其它 3组比较,有统计学意义,切片见片状坏死区明显缩小、坏死细胞数量明显减少;处理后 7d,除MVD结果与HMME组比较有统计学意义(P=0.0496)外,MVD与 US或对照组比较,无统计学意义。VEGF表达率与其它 3组类似,无统计学意义,切片未见明显坏死细胞。SDT组和 US组 MVD密度较高、VEGF蛋白表达较强的区域坏死细胞分布较少。SDT组 MVD与凋亡率的 r=-0.81(P＜0.01);VEGF蛋白表达率与凋亡率的 r=-0.93(P＜0.01)。

表1 4组大鼠凋亡率(%)的比较(±s,n=8)

与 SDT组比较△P＜0.01;与对照组比较*P＜0.01

24h(%) 3d(%) 7d(%)SDT组US组HMME组对照组25.10±0.82*6.28±0.68△*0.30±0.30△0.43±0.38△1.23±0.54*0.35±0.40△0.18±0.23△0.38±0.36△0.23±0.23 0.13±0.28 0.28±0.51 0.23±0.29

表2 4组大鼠 MVD的比较(±s,n=8)

与 SDT组比较△P＜0.05,△△P＜0.01;与对照组比较*P＜0.01

24h 3d 7d SDT组US组HMME组对照组27.88±1.15*71.28±1.34△△71.65±1.25△△72.08±1.46△△44.15±1.01*74.05±1.23△△74.28±1.05△△73.70±1.68△△71.33±1.18 71.35±1.13 72.58±1.04△71.93±1.37

表3 4组大鼠 VEGF蛋白表达率(%)的比较(±s,n=8)

与 SDT组比较△P＜0.01;与对照组比较*P＜0.01

24h(%) 3d(%) 7d(%)SDT组US组HMME组对照组8.98±0.59*45.83±2.28△46.00±1.92△47.20±1.27△35.83±1.28*47.90±1.32△47.08±0.85△47.25±2.01△46.98±0.81 46.45±1.54 46.83±0.59 47.10±1.28

3 讨论

恶性胶质瘤有丰富的异常血管,内皮细胞的活化和增生是肿瘤血管生成的前提,在胶质瘤微环境中,肿瘤细胞产生的各种促血管生长因子作用的主要靶细胞亦是内皮细胞,而 VEGF是胶质瘤血管生成的主要调节因子,胶质瘤新生毛细血管的密度与胶质瘤产生的 VEGF表达量呈正相关[3]。VEGF分子量为 34～46kD,是多肽血管生长因子,胶质瘤细胞分泌的 VEGF通过旁分泌方式作用于血管内皮受体,经酪氨酸激酶传导通路发挥功效。VEGF功能是：(1)增加 MV通透性,促进血浆纤维蛋白外渗,为血管生成过程中多种细胞迁移提供了纤维网络;(2)通过与内皮细胞上两个 VEGF受体 Flt1(fms样酪氨酸激酶)和 flk(胎肝激酶)作用,直接刺激内皮细胞增殖,并产生纤维蛋白溶解酶原激活剂(组织型和尿激酶型)和胶原酶等。这不仅可促进内皮细胞移位,有利于血管生成,而且还有利于肿瘤细胞脱落进入血管或向邻近纤维蛋白和结缔组织基质扩散,为肿瘤的浸润和转移创造了条件。2003年李永利的研究表明[4],应用 VEGF抗体不但可抑制大鼠 C6胶质瘤的血管形成及肿瘤生长,还可诱导肿瘤细胞凋亡。

研究已经证实 SDT可引起体外 C6胶质瘤细胞凋亡[1],通过原位细胞凋亡检查,发现大鼠颅内胶质瘤在 SDT处理后早期(24h)肿瘤组织凋亡达到高峰,随后凋亡的瘤细胞均逐渐减少,至处理后 7d时肿瘤组织中已见不到凋亡的瘤细胞,这表明凋亡是SDT杀伤胶质瘤的重要方式,凋亡高峰出现于处理后早期(24h),但凋亡时间较体外(6h)略后移,这可能因为 US作用于体外细胞时衰减低,而作用于颅脑组织中衰减增强,与较低的声强度启动细胞凋亡时间较长有关。24h后细胞凋亡明显减少,处理后 7d,4组凋亡率已无统计学意义,表明 SDT仅在处理后24h内对细胞凋亡存在明显影响,而中远期则无影响。US处理后也可引起胶质瘤细胞凋亡,其高峰同样发生在早期(24h),但肿瘤细胞凋亡率明显较 SDT低,提示,凋亡也是 US杀伤体内胶质瘤的方式之一。单用 HMME未显示出对细胞凋亡有影响。

我们观察了 4组大鼠颅内胶质瘤 MVD、VEGF的变化,结果表明,SDT处理后极早期(24h)MVD及VEGF表达明显下降,处理后早期(3d)MVD及 VEGF表达有所上升,但仍较其它 3组低,直至处理后中期(7d)VEGF表达才恢复正常。MVD与 HMME组比较,虽有统计学意义,但 P=0.0496,结果尚需具体分析。这提示 SDT对体内胶质瘤杀伤有明显的血管靶向作用。SDT处理后 MVD及 VEGF表达结果与凋亡率成负相关(P＜0.01),提示 SDT可通过损伤血管、抑制肿瘤的血管形成、造成肿瘤细胞缺血、缺氧,从而引起肿瘤细胞中低氧诱导因子-1(HIF-1)表达增加,通过bcl-2途径诱导胶质瘤细胞凋亡[4]。单用 US和单用HMME后 MVD及 VEGF表达强度与对照组无明显差异,提示US和 HMME无血管靶向作用,US的抑瘤效应可能与血管靶向作用无关。