针药结合对乳腺增生大鼠血清及乳腺VEGF、bFGF含量的影响

段彦苍， 杜惠兰， 靳亚慈

(河北医科大学中西医结合学院，河北石家庄050091)

乳腺增生病隶属于中医学的“乳中结核”、“乳疬”等范畴。乳腺增生病在病理方面除了表现在上皮细胞、间质细胞、腺泡、导管等组织的增生外，亦存在着血管的增生［1］。目前血管内皮生长因子(VEGF)和碱性成纤维细胞生成因子(bFGF)被认为是乳腺癌特异性最强的两种血管因子。我们推测乳腺增生中血管的生成可能与VEGF和bFGF密切相关。因此我们采用肌注外源性激素的方法复制乳腺增生大鼠模型，应用放免和免疫组织化学技术探讨乳腺增生病变与血清、乳腺VEGF和bFGF的关系以及针药协同作用对血清、乳腺VEGF和bFGF的调节治疗机制。

材料和方法

1 动物

选用健康清洁级♀性Wistar大鼠60只，75～85日龄，体重(220±20)g，由河北医科大学试验动物中心提供，合格证号:602089。

2 药物和试验试剂

试验所用中药(柴胡、郁金、赤芍、白芍、川楝子、丹参、丹皮、橘核、王不留行、夏枯草、牡蛎、荔枝核、山慈菇)采用传统的煎煮方法，过滤，离心，浓缩制成水煎液，每毫升约含生药2.75 g，密封分装，4℃放置备用。

苯甲酸雌二醇注射液、黄体酮注射液均由天津金耀氨基酸有限公司生产。枸橼酸他莫昔芬由上海医药集团有限公司华联制药厂生产。

VEGF和bFGF酶联免疫试剂盒，购于美国R-D公司。E2、P放免试剂盒购于美国DSL公司。PRL放免试剂盒购于天津九鼎医学生物工程有限公司。

3 试验方法

3.1 动物分组

综上所述，Hp阴性萎缩性胃炎患者应用替普瑞酮治疗的临床效果更加显著，不仅可以减轻胃黏膜病变程度，改善临床症状，还可以减少不良反应的发生。

大鼠适应性喂养2周后，按随机数字表法将其分为6组，每组10只:即正常组、模型组、模型+针刺组(简称“针刺组”)、模型+中药组(简称“中药组”)、模型+针刺+中药组(简称“针药组”)、模型+TAM阳性对照组(简称“对照组”)。

3.2 复制模型

除正常组大鼠常规喂养外，其余组参照张璐［2］等造模方法，大鼠腹腔注射苯甲酸雌二醇0.5 mg/(kg/d)，连续25 d，然后注射黄体酮5 mg/(kg/d)，连续5 d，建立大鼠乳腺增生模型。

3.3 治疗方法

从第31天开始，各组分别治疗。针刺组:根据《中国兽医针灸学》结合人体穴位，选取屋翳、合谷、膻中、足三里，每日1次，9次为一疗程，疗程间休息1 d，共30 d。中药组:按25g/(kg/d)灌服中药，30 d。针药组:针刺操作同针刺组，同时灌服中药，剂量同中药组，30 d。对照组:TAM 1.9 mg/(kg/d)，相当于临床等效剂量，30 d。正常组和模型组灌服同体积蒸馏水，30 d。

4 标本制备和检测方法

末次治疗5 h后，用游标卡尺测量第2对乳房的直径。断头取血，制备血清，置－70℃保存，用放射免疫法测定血清E2、P和PRL含量，酶联免疫法测定血清VEGF和bFGF含量。切取第2对乳房，甲醛固定，常规石蜡包埋切片(4 μm)，免疫组织化学染色(按ABC试剂盒操作指南进行)。

美国IPP(Image-proplus)分析软件对免疫组化染色切片进行图像分析，每个切片采集5个视野，得出度量物质含量信息的灰度等级，将所得灰度值取平均数作为统计指标。平均灰度与阳性表达强弱成反比，灰度值越小，阳性染色越强，蛋白表达越多。

所有数据用均数±标准差表示。用SPSS12.0统计软件进行统计处理，对所测定结果进行正态性及方差齐性检验，组间比较用单因素方差分析，检验以P<0.05为有统计学意义。

结果

1 大鼠乳头直径的变化(见表1)

乳腺增生模型组大鼠的乳头竖起，较坚实，充血，增高2～3 mm。正常组的乳头形态与试验开始时一样，隔毛看不见乳头位置，将毛分开后，仅见乳头呈小米样，紧贴在皮肤上，苍白、柔软、个别稍隆起1 mm左右。针刺组、中药组、对照组和针药组乳头直径均减小，其中对照组和针药组乳头直径明显减小，与模型组相比有显著性差异。

表1 各组大鼠乳头的直径变化比较(±s)

表1 各组大鼠乳头的直径变化比较(±s)

注:与正常组比较*P<0.05，**P<0.01;与模型组比较ΔP<0.05，ΔΔP<0.01。

组别 动物数/只 乳头直径/μm正常组10 1.085±0.064模型组 10 1.311±0.063**针刺组 10 1.251±0.038**Δ中药组 10 1.253±0.055**Δ针药组 10 1.186±0.051**ΔΔ对照组 10 1.215±0.032**ΔΔ

2 血清生殖激素变化(见表2)

治疗后与模型组相比，针刺组和中药组大鼠血清E2水平降低(P<0.05)，针药组和对照组大鼠血清E2水平明显降低(P<0.01);针药组血清 PRL含量水平降低(P<0.05);针药组血清中P的含量升高(P<0.01)，和正常组无统计学差异。

表2 各组大鼠血清E2、P、PRL变化比较(±s)

表2 各组大鼠血清E2、P、PRL变化比较(±s)

注:与正常组比较*P<0.05，**P<0.01;与模型组比较ΔP<0.05，ΔΔP<0.01。

组别 动物数/只 E2/(pg/mL) P/(ng/mL) PRL/(ng/mL)正常组10 15.238±8.218 57.047±17.014 7.947±1.459模型组 10 36.864±20.599**31.571±5.821** 9.912±4.206*针刺组 10 22.974±12.067Δ 43.492±18.742 8.349±1.202中药组 10 21.191±16.587Δ 45.362±20.310 8.363±1.049针药组 10 15.759±10.912ΔΔ 55.311±18.727ΔΔ 7.987±1.188Δ对照组 10 19.257±13.439ΔΔ35.402±14.929**8.217±0.735

3 血清VEGF、bFGF的变化(见表3)

与正常组相比，模型组大鼠血清中VEGF和bFGF的含量明显升高，其它组含量均降低，尤其针药组降低明显(P<0.01)。

表3 各组大鼠血清VEGF、bFGF的变化比较(±s)

表3 各组大鼠血清VEGF、bFGF的变化比较(±s)

注:与正常组比较*P<0.05，**P<0.01;与模型组比较ΔP<0.05，ΔΔP<0.01。

组别 动物数/只 VEGF/(pg/mL) bFGF/(pg/mL)正常组10 16.414±3.798 244.370±57.431模型组 10 21.357±4.816** 507.900±79.051**针刺组 10 20.114±5.501* 446.375±73.120**中药组 10 18.117±2.735 444.440±65.137**Δ针药组 10 15.400±2.285ΔΔ 406.350±55.675**ΔΔ对照组 10 17.239±2.978Δ 264.010±78.394ΔΔ

4 乳腺组织VEGF、bFGF的表达

VEGF、bFGF的阳性表达定位于细胞浆内，为棕黄色染色。与正常组相比，模型组大鼠乳腺组织中VEGF、bFGF的表达增强(P<0.01)。治疗后，针刺组、中药组和针药组VEGF、bFGF的表达均明显低于模型组(均P<0.01);对照组与模型组比较有降低的趋势，但两组之间比较无统计学意义(P>0.05)。(表 4、图 1，2)

表4 各组大鼠VEGF、bFGF表达平均灰度比较(±s)

表4 各组大鼠VEGF、bFGF表达平均灰度比较(±s)

注:与正常组比较*P<0.05;**P<0.01;与模型组比较ΔP<0.05，ΔΔP<0.01。

组别 动物数/只VEGF bFGF正常组10 84.76±8.30 102.00±4.90模型组 10 62.89±8.05** 77.61±5.08**针刺组 10 71.09±6.28**ΔΔ 86.24±3.30**ΔΔ中药组 10 75.13±2.80**ΔΔ 87.29±5.24**ΔΔ针药组 10 88.25±6.57ΔΔ 100.05±8.42ΔΔ对照组 10 64.96±7.24** 80.45±4.95**

讨论

乳腺增生是女性常见病，多数学者认为乳腺增生病的发生与内分泌紊乱、卵巢功能失调造成体内长时间的P不足、E2绝对或相对增多有关。乳腺增生病被认为是乳腺癌癌前的一种良性病变，血管增生在乳腺肿瘤的生长过程中起到了重要作用。VEGF在健康成人组织中维持正常的血管密度和基本的渗透功能，以利于营养物质的运输，但表达水平极低，是机体内皮细胞特异性的分裂原和血管增生因子，对血管生成和血管通透性增加有重要的调节功能［3］。VEGF通过刺激血管新生促进肿瘤细胞的生长和转移，是目前所知的作用最强，选择性最高的内皮细胞丝裂原，是肿瘤血管生成过程中的重要调节因子［4］。VEGF及其受体通过旁分泌途径联合调控内皮细胞分化、血管生成［5］;又通过自分泌调节功能协调其功能的完成。在血管形成的调控中，bFGF起着关键作用。bFGF能促进表皮、内皮细胞再生，促进血管内皮细胞分裂，诱导其从基膜中分离出来，以刺激内皮细胞向肿瘤组织趋化运动，并形成管状结构，还可提高组织中血纤维蛋白溶解酶原激活因子类(PAs)，诱导内皮细胞产生其他蛋白酶，是血管形成较为直接的诱导物质。bFGF亦能通过自分泌和旁分泌形式促进肿瘤的生长与转移［6］。

图1 VEGF在各组乳腺的表达(×200)

图2 bFGF在各组乳腺的表达(×200)

在乳腺增生模型大鼠的血清中，存在着VEGF和bFGF的高含量，在局部组织中存在着VEGF和bFGF的高表达，我们认为在乳腺增生模型大鼠中存在着血管增生，乳房局部已经存在微循环障碍。VEGF和bFGF可能通过一定的途径被激活后，通过某种共同的机制促使乳腺组织局部的增生。针药结合可能通过下调VEGF和bFGF，减少病变区域的血流信号，加快血流速度，以改善乳腺组织的微循环、改变乳腺组织的血管数目和形状，从而达到治疗目的。同时提示我们针药结合的治疗方法，与单纯服用中药、单纯应用针灸以及西药三苯氧胺(TAM)相比较，疗效显著，作用广泛。这为中医药干预治疗乳腺增生病提供了实验依据。

［1］刘胜春，吴凯南，历江元.血管生成在乳腺非典型增生及癌变过程中的作用［J］.中国肿瘤临床，1998，23(6):421-424.

［2］张 璐，乌兰·格日乐，乔国芬，等.中药乳腺丸对鼠乳腺增生的影响［J］.中国中西医结合外科杂志，2003，9(1):39-41.

［3］Kroll J，Waltenberger J.Regulation of the endothelial function and angiogenesis by vascular endothelial growth factor-A(VEGF-A)［J］.Z Kardiol，2000;89(3):206-218.

［4］Ferra N.Vascular endothelial growth factor:molecular and biological aspects［J］.Curr Top Microbiol Immunol，1999;237:1-30.

［5］Gerwins P，Sloidenberg E，Claesson W L.Function of fibroblast growth fact and VEGF and their receptors in angiogenesis［J］.Crit Rev Oncol Hematol，2000;34(3):185-194.

［6］易文君，唐中华，杨竹林，等.青年和绝经女性乳腺癌VEGF、bFGF及其受体表达的差异［J］.中华肿瘤杂志，2003，25(2):141-144.