黑曲霉固态发酵花生壳提取水溶性膳食纤维

李红霞，吕敬军，陆丰升，于丽娜，王世清，杨庆利,*，毕 洁，孙 杰，张初署

黑曲霉固态发酵花生壳提取水溶性膳食纤维

李红霞1,2，吕敬军3，陆丰升4，于丽娜2，王世清1，杨庆利2,*，毕 洁2，孙 杰2，张初署2

(1.青岛农业大学食品科学与工程学院，山东 青岛 266109；2.山东省花生研究所，山东 青岛 266100；3.临沂市农业委员会，山东 临沂 276000；4.沂水县林业局，山东 沂水 276400)

以花生壳为原料，应用黑曲霉固态发酵制备花生壳水溶性膳食纤维。通过对黑曲霉菌株特性及其培养基优化的研究，确定培养温度、菌龄、接种量、培养时间的最佳水平，响应面辅助法获得花生壳水溶性膳食纤维的最佳提取工艺条件为：以8g花生壳为原料，水1.88mL/g原料，(NH4)2SO41.88g/100mL、KH2PO41.88g/100mL和MgSO4 5.63g/100mL的优化培养基，培养温度27℃、黑曲霉菌龄2.9d、接种量16mL、培养时间9.1d，黑曲霉发酵液水解花生壳酶解率可以达到11.03%，水溶性膳食纤维中已糖的聚合度为152.71%，综合评分为105.48。

水溶性膳食纤维；黑曲霉；固态发酵；提取

誉为第七大营养素的膳食纤维(dietary fiber，DF)按溶解性分为水溶性膳食纤维(soluble dietary fiber，SDF)和水不溶性膳食纤维(insoluble dietary fiber，IDF)两大类[1]。其中水溶性膳食纤维(SDF)是指可溶于温、热水且其水溶液又能被其4倍体积的乙醇再沉淀的，但不被人体消化道酶消化的那部分膳食纤维[2]。跟水不溶性膳食纤维(IDF)比较，SDF在预防结肠癌，预防心血管疾病，降低胆固醇等方面具有更强的生理功能[3-4]，SDF还能刺激产生胰岛素，降低血脂含量、延缓小肠对葡萄糖的吸收速度，从而预防糖尿病的发生[5]。水溶性膳食纤维作为一种多功能保健性食品基料，早已引起世界各国营养学家的极大关注。

我国是世界花生生产、消费和出口大国，花生总产量和出口量均居世界前列。在花生加工过程中，花生壳是花生加工的下脚料[6]。花生壳富含纤维素、半纤维素和木质素等粗纤维，是天然膳食纤维很好的来源。近年来，有关提取膳食纤维的报道不少[7-12]，但未见利用黑曲霉法从花生壳中提取膳食纤维的报道。而微生物发酵产酶进行提取功能性物质已成一种趋势，微生物固态发酵具有设备投资少、操作成本低，可使用农副产品作原料、易推广等优点。而黑曲霉属于丝状真菌，适合采用固态发酵的方式，且是国际上公认的可用于食品的安全菌株[13-16]，因此本实验以黑曲霉为菌株，采用固态发酵方法产SDF，旨在为水溶性膳食纤维的制备和花生壳的变废为宝提供新途径，同时促进花生加工副产品的高值化利用。

1 材料与方法

1.1 材料

花生壳为山东省花生研究所莱西实验站2008年9月收获的花育19品种，挑选无霉烂和虫蛀的花生壳，清水洗净，烘箱中80℃干燥，植物粉碎机粉碎，过50目筛，取筛下物作为实验用原料。

1.2 菌种与培养基

黑曲霉(Aspergillus niger 30786)，由中国农业微生物菌种保藏管理中心提供。

PDA培养基(g/L)：马铃薯20、葡萄糖2、琼脂2；PDY培养基(g/L)：马铃薯20、葡萄糖2、酵母膏1；发酵基础培养基(g/L)：花生壳粉8g、15mL蒸馏水、(NH4)2SO41.88、KH2PO41.88、MgSO45.63。

1.3 方法

1.3.1 黑曲霉活化、扩大、转代的培养方法

菌种活化：用无菌吸管取0.2mL菌体悬浮液，移植于PDA培养基上，27℃培养箱中培养3d。

扩大培养：用接种针从活化的培养基上挑1环活化孢子于PDA培养基上，27℃温度培养箱中培养3d。

种子培养：将扩大培养基上的孢子用无菌水淋洗制成悬浮液，再接入装有100mL PDY培养基中，于27℃摇床150r/min振荡培养3d。

1.3.2 菌株的特性

生长曲线测定：向250mL三角瓶中加入100mL PDY培养基，接入菌龄3d的10mL孢子悬浮液，于27℃摇床150r/min振荡培养8d，每隔0、0.5、1.0、1.5、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0d取样1次，平行取3个点，测定菌体生物量，作出生长曲线。

pH值的选择：向250mL三角瓶中加入100mL PDY培养基，接入菌龄3d的10mL孢子悬浮液，pH值分别设定为5.5、5.8、6.1、6.4、6.7、7.0，每个pH值取3个平行样，于27℃摇床150r/min振荡培养8d，测定菌体生物量、pH值。

1.3.3 SDF的提取

经过预处理的花生壳粉采用黑曲霉固态发酵法提取SDF。称取8g的经预处理的花生壳粉灭菌后，无菌加入黑曲霉，在21～33℃条件下生长7～11d。加入75～100mL的水后，在45℃水浴中振荡培养4h，抽滤，保留滤液，即发酵液。滤渣在60℃条件下干燥，称其质量。发酵液灭菌后，真空旋转蒸发浓缩，在浓缩液中加入4倍无水乙醇，静置过夜，抽滤，滤液浓缩后再加4倍无水乙醇，抽滤，收集两次沉淀溶于沸水中，离心，上清液浓缩后加4倍无水乙醇、抽滤，沉淀干燥得到由黑曲霉固态发酵花生壳粉制备的SDF。

1.3.4 发酵工艺及响应面试验设计

在黑曲霉发酵花生壳粉制备SDF实验中，加水量、培养时间、固体发酵培养基碳、氮源等条件都会影响SDF的提取。因此，本研究在确定这3个因素的最佳条件之后，以温度(A)、菌龄(B)、接种量(C)、培养时间(D)4个因素进行响应面试验，以SDF中己糖的聚合度、黑曲霉发酵液水解花生壳的酶解率和综合评分为评价指标，确定最佳工艺参数。

1.3.5 评价指标综合评分的确定[17]

评价指标综合评分由SDF中己糖的聚合度和黑曲霉发酵液水解花生壳的酶解率两项结果组成，采取100分制。考虑它们的重要程度，取权重比为己糖的聚合度:酶解率=2:1。

采用苯酚-硫酸法测定己糖质量浓度：取发酵液或发酵液水解液(发酵液加入体积分数4%硫酸在120℃条件下水解2h)2mL，加入1mL苯酚和5mL硫酸，混匀。以空白样调零，在波长490nm处测定吸光度，根据标准曲线计算其中的己糖质量浓度。

式中：C1为发酵液中己糖的质量浓度/(μg/mL)；C2为发酵液水解液中己糖的质量浓度/(μg/mL)。

式中：m1为黑曲霉发酵前花生壳粉总质量/g；m2为黑曲霉发酵后烘干的花生壳粉总质量/g。

2 结果与分析

2.1 黑曲霉生长曲线

图1 黑曲霉生长曲线Fig.1 Growth curve of Aspergillus niger

由图1可知，在第3天黑曲霉的生物量达到最高值，6d后呈现明显的衰减趋势。由此可知，在标准PDY培养基中，黑曲霉生活周期为7d左右，接种后前24h，生物量并不高，属于延迟期，24～32h处于指数生长期，第3天至第7天属于稳定期，7d后属于衰亡期。稳定期为积累菌代谢产物的重要时期，菌在这一时期将分泌多种降解酶类，随着营养物质的被利用和代谢产物的积累，环境因子随之发生改变，菌体进入衰亡期，无法继续提供代谢产物。所以取菌龄3d的孢子悬浮液作为实验用菌。

2.2 pH值的确定

表1 pH值对黑曲霉菌体生物量的影响Table 1 Effect of pH on Aspergillus niger biomass

由表1可知，初始pH值在6.4～6.7左右，较适合黑曲霉菌株生长，最终pH值维持在1.98左右。说明pH值对微生物的生长和代谢产物的积累有重要影响，所以用pH6.4作为试验用pH值。

2.3 加水量的确定

经过预处理的花生壳粉8g，分别加水0、0.625、1.25、1.88、2.5、3.13mL/g原料(即0、5、10、15、20、25mL)，温度27℃，接种量15mL，菌龄3d，培养时间8d，每组试验重复3次，研究加水量对SDF提取的影响，结果见图2。

由图2可知，加水量对膳食纤维的含量有一定的影响，且随着加水量的增加，SDF的酶解率和综合评分有所增加而后减少。含水量过少时，无法满足黑曲霉孢子萌发菌丝生长所需湿度，产酶较少；含水量过大时，湿度过大，造成培养基的通气、散热差，培养基易结块成团而抑制微生物产酶[18]，考虑SDF含量，当加水量为1.88mL/g(15mL)时，SDF的相对含量达到最大，SDF的综合评分最高。

图2 加水量对SDF提取的影响Fig.2 Effect of water amount on SDF extraction

2.4 培养时间的确定

经过预处理的花生壳粉8g，加入15mL水，温度27℃，接种量15mL，菌龄3d，培养时间分别为0、2、4、6、8、10、12、14、16d，每组试验重复3次，研究培养时间对SDF提取的影响，结果见图3。

图3 培养时间对SDF提取的影响Fig.3 Effect of Aspergillus niger fermentation period on SDF extraction

由图3可知，在6～12d左右，产品中己糖的聚合度维持在较高水平。这与黑曲霉的生长周期基本相符，8d后菌体完成了代谢产物的积累，进入衰亡期，不能继续降解和转化原料中的纤维素类物质，同时菌体量减少，菌体中膳食纤维量也随之减少，造成发酵产物中膳食纤维含量下降。

2.5 培养基条件的优化[19]

经过预处理的花生壳粉8g，加入15mL水，加入KH2PO4、MgSO4和(NH4)2SO4，温度27℃，接种量15mL，菌龄3d，培养时间8d，每组试验重复3次，研究培养基对SDF提取的影响，结果见表2。

表2 黑曲霉固态发酵花生壳培养基条件的优化Table 2 Results of orthogonal array optimization of medium composition for Aspergillus niger fermentation

表3 黑曲霉固态发酵花生壳培养基优化条件的方差分析Table 3 Variance analysis of the results of orthogonal array optimization of medium composition for Aspergillus niger fermentation

从表2、3可以看出，第3试验组A1B3C3为最优培养基优化组合，(NH4)2SO4和KH2PO4对SDF的提取影响差异显著(P＜0.05)。即(NH4)2SO4和KH2PO4质量浓度的大小对SDF的提取最重要，MgSO4对SDF的提取影响不大。从极差R和F值也可以看出，FC＞FA＞FB，说明各因素对SDF的提取影响的主次顺序为C＞A＞B，即(NH4)2SO4＞KH2PO4＞MgSO4，最优水平组合为A1B1C3，这与用极差R的判断结果一致。由于表中没有A1B1C3组合，必须对其进行验证性实验。在A1B1C3的组合条件下，酶解率8.32%，聚合度142.78%，综合评分97.96。故确定培养基优化条件为A1B1C3。即最优培养基配方：花生壳粉8g、水1.88mL/g原料、(NH4)2SO41.88g/100mL、KH2PO41.88g/100mL和MgSO45.63g/100mL，在此条件下，酶解率8.32%，聚合度142.78%，综合评分可达97.96。

2.6 响应面分析法确定重要因素的最佳水平

表4 响应面因素水平设计表Table 4 Factors and levels in the response surface design for optimizing fermentation conditions of Aspergillus niger

根据中心组合试验设计原理，考察X1培养温度、X2菌龄、X3接种量和X4培养时间对SDF提取(Y)的影响[20]，因素及水平见表4，结果见表5。

表5 响应面试验设计与结果Table 5 Response surface design for optimizing fermentation conditions of Aspergillus niger experimental results

2.6.1 模型的建立及显著性检验

对自变量编码X1、X2、X3和X4进行回归分析，得二次多项回归方程为：

Y=104.39＋0.017X1－2.08X2＋2.84X3＋1.59X4＋3.14X1X2＋1.84X1X3－2.76X1X4＋40.99X2X3＋1.24X2X4＋3.20X3X4－13.18X12－7.98X22－10.01X32－8.10X42

通过Design-Expert软件进行方差分析来验证回归模型及各参数的显著性，结果见表6。

由表6方差分析可以看出，模型P值远小于0.05，表示模型方程极显著，模型失拟项不显著，模型选择适合。因此可以用该模型方程来分析和预测不同条件下SDF提取情况。方程中X3、X12、X2.2、X32、X42对Y的影响极显著，X2、X1X2、X1X4、X3X4对Y的影响显著，表明试验因素对响应值的影响并非呈线性关系。通过直接比较方程中一次项系数绝对值的大小，可以判断因素影响的主次性。对SDF提取情况影响的大小依次是接种量、菌龄、培养时间、培养温度，即接种量对SDF提取影响最显著，菌龄对SDF提取也较显著。

表6 模型的方差分析结果Table 6 Variance analysis for the developed quadratic regression model based on response surface design

2.6.2 因素交互作用分析

响应面图中一个响应曲面坡度相对平缓，表明SDF提取的综合评分可以忍受处理条件的变异，而不影响到响应值的大小；相反，一个响应曲面非常的陡峭，表明响应值对处理条件的改变非常敏感。等高线图表示在同一个椭圆形的区域里面，SDF提取的综合评分是相同的。在椭圆形区域中心，SDF提取的综合评分最好，由中心向边缘逐渐减少。图中椭圆排列越密集，说明该因素变化对SDF提取影响越大。同时等高线的形状可以反映出交互效应的强弱大小，椭圆形表示两因素交互作用显著；而圆形与之相反，此时两因素交互作用可以忽略。

图4 培养温度和菌龄交互作用对SDF提取的影响Fig.4 Response surface plot illustrating the interactive effects on fermentation temperature and seed age on SDF extraction

由图4可知，温度和菌龄两因素的交互作用显著，温度较低时，SDF综合评分随着菌龄的增加而减小；温度较高时，SDF综合评分随着菌龄的增加先增加而后减少。最优点接近于温度为27℃，菌龄为2.9d。从等高线图可知，该过程温度的变化与菌龄的变化对SDF综合评分的影响作用强弱为：菌龄的变化＞温度的变化。

图5 培养温度和培养时间交互作用对SDF提取的影响Fig.5 Response surface plot illustrating the interactive effects on fermentation temperature and period on SDF extraction

由图5可知，温度和培养时间两因素的交互作用显著，温度较低时，SDF的综合评分随着培养时间的增加而减小；温度较高时，SDF综合评分随着培养时间的增加先增加而后减少。最优点接近于温度为27℃，培养时间为9.1d。从等高线图可知，该过程温度的变化与培养时间的变化对SDF综合评分的影响作用强弱为：培养时间的变化＞温度的变化。

图6 接种量和培养时间作用对SDF提取的影响Fig.6 Response surface plot illustrating the interactive effects on fermentation period and inoculum size on SDF extraction

由图6可知，接种量和培养时间的交互作用显著，接种量较少时，SDF综合评分随着培养时间的增加先增加后减少；接种量较大时，SDF综合评分随着培养时间的增加而增加。最优点接近于接种量为15mL，培养时间为9.1d。从等高线图可知，该过程温度的变化与菌龄的变化对SDF综合评分的影响作用强弱为：接种量的变化＞培养时间的变化。

2.6.3 提取条件的优化及验证

进一步用Design-Expert软件对试验模型进行典型性分析，以获得最优的提取条件。经分析得，培养温度26.95℃、菌龄2.89d、接种量15.77mL、培养时间9.12d，在此点预测的综合评分为104.825。考虑到试验的实际情况，确定培养温度27℃、菌龄2.9d、接种量16mL、培养时间9.1d，在其余培养基成分和培养条件不变的情况下，酶解率为11.03%，聚合度为152.71%，综合评分达105.48，与预测实验结果相差不大，说明响应面优化工艺比较有效。

3 结 论

通过对黑曲霉菌株特性及其培养基优化的研究，以及培养条件的优化确定出优化培养基的成分是：花生壳粉8g、水1.88mL/g原料、(NH4)2SO41.88g/100mL、KH2PO41.88g/100mL和MgSO45.63g/100mL，利用响应面法对黑曲霉固态发酵提取SDF进行了优化。结果表明，培养温度27℃、菌龄2.9d、接种量16mL、培养时间9.1d，在此条件下综合评分达105.48，而制得的SDF产品为淡黄色，有清淡的糖的香味。各因素作用的主次顺序为：接种量＞菌龄＞培养时间＞培养温度。

[1]THEUWISSEN E, MENSINK R P. Water-soluble dietary fibers and cardiovascular disease[J]. Physiology & Behavior, 2008, 94(2): 285-292.

[2]王遂, 李洁. 可溶性膳食纤维提取工艺的研究[J]. 食品科学, 1999, 20(7): 38-40.

[3]YEH S L, LIN M S, CHEN H L. Inhibitory effects of a soluble dietary fiber from Amorphophallus konjac on cytotoxicity and DNA damage induced by fecal water in Caco-2 cells[J]. Planta Med, 2007, 73(13) : 1384-1388.

[4]Panel on the Definition of Dietary Fiber, Standing Committee on the Scientific Evaluation of Dietary Reference Intakes, Food and Nutrition Board. Dietary reference intakes: proposed definition of dietary fibre[M]. Washington D C: National Academy Press, 2001: 1-64.

[5]SAURA-CALIXTO F, GARCIA-ALONSO A, GONI I, et al. in vitro Determination of the indigestible fraction in foods: An alternative to dietary fibre analysis[J]. J Agric Food Chem, 2000, 48(8): 3342-3347.

[6]杨玉玲, 杨晓蓉, 王晔峰, 等. 利用玉米秸芯研制膳食纤维[J]. 冷饮与速冻食品工业, 2000, 6(4): 10-12.

[7]陈军, 宋维春, 徐高升. 从香蕉皮提取膳食纤维研究[J]. 食品科学, 2007, 28(1): 99-101.

[8]田忠, 张小玲, 张粉艳, 等. 桑椹渣中水溶性膳食纤维的提取工艺研究[J]. 应用化工, 2008, 37(6): 661-663.

[9]宋纪蓉, 徐抗震, 黄洁, 等. 利用苹果渣制备膳食纤维的工艺研究[J].食品科学, 2003, 24(2): 69-72.

[10]任保国, 王陆玲, 孙洪, 等. 海带膳食纤维的提纯及其功能活化[J].现代食品科技, 2009, 25(6): 637-638.

[11]王军, 李智勇, 焦艳丽, 等. 柿皮水溶性膳食纤维的提取工艺及基本特性研究[J]. 食品工业科技, 2009(5): 258-261.

[12]宋慧, 马利华, 秦杰, 等. 牛蒡中可溶性膳食纤维提取与初步纯化[J].安徽农业科学, 2009, 37(5): 2038-2040.

[13]MALDONADO M C, STRASSER de SAAD A M. Production of pectinesterase and polygalacturonase by Aspergillus niger in submerged and solide state systems[J]. Journal of Industrial Microbiology and Biotechnology, 1998, 20(1): 34-38.

[14]HUERTA S, FAVELA E, FONSECA A, et al. Absorbed substrate fermentation for pectinase production with Aspergillus niger[J]. Biotechnology Techniques, 1994, 11(8): 837- 842.

[15]李廷生, 王平诸, 宇茹. 果胶酶高产菌株Aspergillus niger 3502的选育[J]. 郑州工程学院学报, 2001, 22(4): 12-14.

[16]张应玖, 郭慧云. 黑曲霉As 3.3883菌种的诱变及其发酵条件探索[J]. 吉林大学: 自然科学学报, 1993(2): 94-98.

[17]于丽娜, 杨庆利, 毕洁, 等. 花生壳水溶性膳食纤维提取工艺的研究[J]. 现代化工, 2008, 28(增刊2): 324-327.

[18]王丽丽, 刘晓兰, 郑喜群, 等. 黑曲霉固态发酵产生果胶酶条件的优化[J]. 食品科技, 2008(5): 17-18.

[19]邓毛程, 王瑶, 李胜. 黑曲霉利用菠萝皮培养基发酵产果胶酶的研究[J]. 中国酿造, 2009(7): 106-108.

[20]冯培勇, 赵彦宏, 张丽. 响应面法优化黑曲霉产纤维素酶发酵条件[J]. 食品科学, 2009, 30(23): 335-339.

Optimization of Extraction of Soluble Dietary Fibre from Peanut Hull by Aspergillus niger Solid-state Fermentation

LI Hong-xia1,2，LU Jing-jun3，LU Feng-sheng4，YU Li-na2，WANG Shi-qing1，YANG Qing-li2,*，BI Jie2，SUN Jie2，ZHANG Chu-shu2
(1. College of Food Science and Engineering, Qingdao Agricultural University, Qingdao 266109, China；2. Shandong Peanut Research Institute, Qingdao 266100, China；3. Linyi Agriculture Committee, Linyi 276000, China；4. Yishui Forestry Bureau, Yishui 276400, China)

In order to promote the high value-added utilization of peanut hull, a byproduct of peanut processing, the solid-state fermentation of Aspergillus niger was employed to extract soluble dietary fibre (SDF) from the resource. The growth curve of Aspergillus niger in standard PDY medium was plotted for determining the optimal seed age. This was followed by optimizing the medium composition by orthogonal array design and four fermentation conditions including temperature, seed age, inoculum size and fermentation period by response surface methodology. The optimal medium composition was found to be composed of 8 g of peanut hull and 1.88-fold volume of water containing 1.88 g/100 mL (NH4)2SO4, 1.88 g/100 mL KH2PO4 and 5.63 g/100 mL MgSO4, and the optimal fermentation period and temperature, seed age and inoculum size were 9.1 days, 27 ℃, 2.9 days and 16 mL, respectively. The resultant hydrolysis efficiency, SDF polymerization degree and comprehensive score were 11.03%, 152.71% and 105.48, respectively.

water soluble dietary fiber；Aspergillus niger；solid-state fermentation；extraction

TS255.1

A

1002-6630(2010)19-0277-06

2010-06-22

国家“863”计划项目(2007AA10Z189；2006AA10A114)；国家现代农业产业技术体系专项 (nycytx-19)

李红霞(1983—)，女，硕士研究生，研究方向为食品科学与工程。E-mail：yanxia-102500@163.com

*通信作者：杨庆利(1977—)，男，助理研究员，博士，研究方向为花生综合利用与花生功能食品开发。E-mail：rice407@163.com