沙苑子提取液对不同体系中草酸钙晶体生长影响的研究

王 萍沈玉华谢安建

(1安徽大学化学化工学院，合肥 230039)

(2安徽省中医学院药学院，合肥 230031)

沙苑子提取液对不同体系中草酸钙晶体生长影响的研究

王 萍1,2沈玉华＊,1谢安建1

(1安徽大学化学化工学院，合肥 230039)

(2安徽省中医学院药学院，合肥 230031)

通过与水、氯化钠、正常人尿液体系的比较，重点研究了结石患者尿液体系中加入中药沙苑子提取液对草酸钙晶体生长的的影响，利用SEM，FTIR和XRD等测试手段对所得晶体进行表征。结果发现：在结石患者尿液体系中形成的草酸钙晶体为一水草酸钙(COM)晶体，而在这4种体系中加入沙苑子提取液后，只形成二水草酸钙(COD)晶体，表明沙苑子提取液能抑制COM晶体生长,并且随着沙苑子提取液浓度增大，抑制作用增强。沙苑子抑制草酸钙晶体生长的可能机理进行了探讨。

草酸钙；泌尿系统结石；沙苑子；抑制

尿结石是一种危害人类健康的常见病和多发病，其中60%～80%为含草酸钙的结石[1-2]，近年来人们从不同角度对尿结石的形成及抑制因素进行广泛研究[3-6]，但对其作用机理仍然不十分清楚。

中草药方剂治疗泌尿系统结石历史悠久，因其疗效显著，且副作用少等优点而备受关注。近年来人们开始从生物矿化的角度探索单味中草药对尿结石形成的影响及其作用机理[7-9]。这种研究对于寻找有效防治尿结石的药物具有重要的临床意义。

研究尿结石最常见的体系有水溶液、人工尿液以及正常人尿液[10-12]等。由于结石的形成是建立在有机基质调控的基础上，尿液中有机分子的物种和浓度在结石形成过程中起着重要作用[13]，为了更接近体内结石生长的真实环境，我们选择正常人和结石患者尿液体系，研究中药对草酸钙晶体生长的影响，并与水体系及氯化钠体系的晶体生长进行比较。

中药沙苑子为豆科植物扁茎黄芪(Astragalus complanatus R.Brown)的干燥成熟种子，具有补肝、益肾明目、固精等功效。沙苑子中主要含有氨基酸、黄酮类、三萜类、有机酸等成分。氨基酸中含量最多的为谷氨酸，约占总氨基酸的68%，其次为天冬氨酸，约占14%。黄酮类成分主要为沙苑子苷、沙苑子新苷、山奈酚等[14-16]。据文献报道，氨基酸和黄酮对草酸钙晶体的生长都有一定的影响[17-19]，因此我们选择该味中药进行研究，以期发现其可能在治疗尿结石方面的新的功效。

1 实验部分

1.1 试剂及仪器

草酸钠(北京化工厂)，无水氯化钙(上海泗联化工厂)，叠氮化钠(浙江东阳天宇化工有限公司)，氯化钠(上海化学试剂有限公司)，以上药品皆为分析纯。水为二次水。

沙苑子(Semen Astragali complanali)，豆科植物扁茎黄芪(Astragalus complanatus R.Brown)的干燥成熟种子。

KYKY-EM3200型扫描电子显微镜 (SEM)(北京中科科仪技术发展有限责任公司)观察晶体形貌，加速电压20 kV；Y-4Q型X射线衍射仪 (丹东射线仪器工业公司)测试物相，测试电压35 kV，电流25 mA，扫描速度 0.06°·s-1。TGL-16G 高速离心机(上海安亭科学仪器厂)。

1.2 实验方法

1.2.1 尿液的处理

收集正常人及尿结石患者的晨尿，加入2wt%的叠氮化钠溶液(10 mL·L-1尿样)防腐，过滤后加入适量0.15 mol·L-1的NaCl溶液稀释，磁力搅拌使之混合均匀，备用。

1.2.2 沙苑子提取液的制备取沙苑子100 g，洗净，碾碎，放于2 L烧杯中，加二次水800 mL，煮沸40 min，过滤，滤渣加二次水600 mL，煮沸30 min，过滤。合并2次滤液，浓缩成含生药浓度为0.5 g·mL-1的沙苑子提取液，用高速离心机离心(16 000 r·min-1)10 min，取上清液，冷藏，用时稀释成所需浓度。

1.2.3 晶体的生长

1.2.3.1 沙苑子提取液对不同体系中草酸钙晶体生长的抑制作用

在洁净的烧杯中加入0.01 mol·L-1的CaCl2溶液20 mL、结石患者尿液120 mL、生药浓度为0.01 g·mL-1沙苑子提取液 40 mL 和 0.01 mol·L-1的Na2C2O4溶液20 mL，使，搅拌均匀，放置一片经过亲水性处理[20]的玻璃片(0.5 cm×0.5 cm)。将烧杯于(10±1)℃恒温放置 3 d，取出玻璃片进行扫描电子显微镜(SEM)测试。烧杯中沉淀离心分离，取出草酸钙晶体，分别用乙醇和二次水洗涤数次，干燥后进行X射线粉末衍射(XRD)测试。

分别用正常人尿液、二次水、0.15 mol·L-1NaCl溶液替换结石患者尿液，同法操作，考察沙苑子提取液对不同体系中草酸钙晶体生长的影响。

1.2.3.2 不同浓度沙苑子提取液对草酸钙晶体生长抑制作用的比较

在结石患者尿液体系中分别加入0.01、0.03、0.05、0.1 g·mL-1沙苑子提取液，按 1.2.3.1 同法操作。

2 结果与讨论

2.1 沙苑子提取液对不同体系草酸钙晶体生长的抑制作用

2.1.1 草酸钙晶体的SEM图像

图1所示为不同体系中生长的草酸钙晶体的SEM图像。图1a、图1b为结石患者尿液中不加沙苑子提取液生长的草酸钙晶体的形貌，图中只出现了归属于COM的六边形晶体[21]，对角线平均尺寸分别为 8.0、4.8、5.2 μm。

图1c为在结石患者尿液中加入0.01 g·mL-1的沙苑子提取液后得到的草酸钙晶体的SEM图像。可以看出，晶体均为归属于COD的四方锥形，但晶体大小不等，大晶体对角线平均尺寸为33.3、33.3 μm，小晶体对角线平均尺寸为18.8、18.8 μm。由图1c可以看出，加入沙苑子提取液后，六边形的COM晶体消失，说明沙苑子提取液具有抑制COM晶体生长的能力。

图1d为正常人尿液中加入0.01 g·mL-1的沙苑子提取液生长的草酸钙晶体形貌图。在该体系中形成了大小不等的四方锥晶体(归属于COD)，大晶体对角线平均尺寸为 12.3、12.3 μm，小晶体对角线平均尺寸为 4.9、4.9 μm。而正常人尿液中生长的草酸钙晶体通常为COM和COD[17]。表明在正常人尿液中沙苑子提取液对COM晶体的生长也具有较强的抑制作用。

水体系及氯化钠体系[20]中生长的草酸钙晶体的形貌均为拉长六边形的COM，在2个体系中分别加入沙苑子提取液后，六边形的COM都转变为四方锥形的COD，但形貌有所不同。水体系中只出现四方锥形晶体(图 1e)，对角线平均尺寸为 20、20 μm。而氯化钠体系中既有四方锥晶体，也有小的四方状晶体(图 f)，前者对角线平均尺寸为 21.1、24.4 μm，后者对角线平均尺寸为 8.3、8.8 μm。小四方晶体的边缘比较圆钝(图f中圆圈中表示部分)，可能是因为草酸钙晶体生长是一个沉淀-溶解的动态过程，沙苑子中有效成分(如氨基酸)与草酸钙晶体表面的钙离子配位生成可溶性的配位物而使晶体溶解，而溶解后的钙离子又可在晶体表面重新沉淀，从而形成圆钝的晶体。

从图1中可以看出，在不同体系中加入沙苑子提取液后，六边形的COM晶体的生长均受到抑制，而只生成了四方锥形的COD。表明沙苑子提取液对COM晶体的形成具有较强抑制作用。

2.1.2 草酸钙晶体的 XRD图

图2所示为不同体系中生长的草酸钙晶体的XRD图。与草酸钙晶体的XRD标准图谱卡片PDF No.20-0231(一水合草酸钙)、PDF No.17-0541(二水合草酸钙)比较，发现在不同体系中生长的草酸钙晶型不同。未加沙苑子提取液的结石患者尿液中只出现了一水合草酸钙 COM特征峰 (图 2a)：d值为0.593，0.365 和 0.298 nm，分别归属于 COM 的(101)面、(020)面和(202)面。

在结石患者尿液中加入沙苑子提取液后，COM晶体衍射峰消失，所有衍射峰均由COD晶体产生，分别归属于 COD 的(200)面、(211)面、(411)面、(213)等(图2b)，表明该体系中生长的晶体为COD。

在正常人尿液和水体系中加入沙苑子提取液后所得晶体衍射峰与结石患者尿液中加入沙苑子提取液后所得的相似，但各峰的相对强弱发生变化(图 2c～d)。(411)面衍射峰增强，表明这 2 个体系中晶体主要沿(411)面生长。而在氯化钠体系中晶体的最强峰由(213)产生，即晶体主要沿(213)面取向生长形成。

2.2 不同浓度沙苑子提取液对草酸钙晶体生长的影响

2.2.1 草酸钙晶体的SEM图像

图3所示为结石患者尿液体系中加入不同浓度沙苑子提取液得到的草酸钙晶体的形貌。图3a为加入0.01 g·mL-1沙苑子提取液后所成的草酸钙晶体。图中均为四方锥形的COD晶体，但晶体大小不等，大晶体对角线平均尺寸为 33.3、33.3 μm，小晶体对角线平均尺寸为 18.8、18.8 μm。

当沙苑子提取液的浓度增大到0.03 g·mL-1时，体系中也只形成COD晶体(图3b)，晶体对角线平均尺寸为 27.8、27.8 μm，晶体比加入 0.01 g·mL-1沙苑子提取液体系中形成的尺寸明显减小。

当沙苑子提取液的浓度增大到0.05 g·mL-1时(图3c)，所得的四方锥晶体更小，对角线平均尺寸为17.5、17.5 μm。

从以上情况可以看出，随着沙苑子提取液浓度的增大，草酸钙晶体尺寸减小，即沙苑子提取液对草酸钙晶体生长的抑制作用逐渐增强。这可能是由于当提取液浓度增大时，其中氨基酸的含量增大，与晶体表面钙离子的配位能力也增大，晶体生长受到的抑制作用也更强。

随着沙苑子提取液的浓度增大到0.10 g·mL-1(图3d)，体系中生成的草酸钙晶体形貌出现了特殊的变化，大多为不完整的四方锥形晶体，晶体的对角线平均尺寸为 15.9、15.9 μm。可能是在较高浓度的沙苑子体系中，沙苑子中有效成分对晶体表面的吸附作用更强，且这种吸附作用对晶体的晶面有较高的选择性，造成晶体生长过程中某些晶面的生长缺陷，从而得到特殊形态的COD晶体。

2.2.2 草酸钙晶体的XRD图

图4为加入不同浓度沙苑子提取液的草酸钙的 XRD图。图 4a～d中主要衍射峰的 d值为0.618，0.442，0.278 和 0.224 nm,分别归属于 COD 晶体的(200)面、(211)面、(411)面和(213)面，表示不同条件下生成的CaC2O4晶体均为COD。

从谱图可以看出，图中主衍射峰的相对强弱不同。图4a中最强峰由(213)面产生，而图4b～d中最强峰均由 (200)面产生，即当沙苑子浓度较低时，COD晶体主要沿(213)面生长，而随着沙苑子浓度的增大，COD的(200)面的衍射峰增强。

2.3 沙苑子提取液对草酸钙晶体生长的抑制机理探讨

沙苑子提取液对草酸钙晶体生长的抑制作用与其所含的主要成份有关。沙苑子中含有酸性氨基酸谷氨酸及天冬氨酸，两者的等电点分别为3.22和2.77，因此在提取液中两者均以带负电荷的羧基形式存在，能通过静电作用与晶体表面的钙离子配位(见图5)。根据溶质分子结晶过程生成晶体的吉布斯自由能公式[22]

C1为溶质的过饱和浓度，C0为溶质的饱和浓度，Ksp(CaC2O4)=C02，C0=Ksp1/2(CaC2O4)，即在一定温度下，C0值为一定，ΔG值随C1增大而减小。由于氨基酸与钙离子的配位，使极性基团周围的钙离子浓度增大，而钙离子又吸引溶液中的草酸根离子，造成局部过饱和度增大，ΔG减小，从而有利于高能COD晶体的生成。因此，在加入沙苑子提取液的体系中只生成COD晶体而没有COM晶体。

另外，氨基酸与钙离子的配位也使之吸附在晶体表面，阻碍了草酸根与钙离子的结合，即封闭晶体生长点，抑制晶核的聚集及生长。随着沙苑子浓度增大，这种作用增强，晶体尺寸变小。再有，吸附在晶体表面的氨基酸羧基的负电荷使晶体表面ζ电位变负，增加了晶体表面离子之间的排斥作用，使晶体的聚集受到抑制。

草酸钙晶体生长过程存在着结晶与溶解的动态平衡：CaC2O4(s)⇌ Ca2++C2O42-，当沙苑子中氨基酸与钙离子配位后，平衡右移，沉淀溶解，溶液中Ca2+离子和C2O42-离子浓度增大。同时，溶液中还存在带电荷的氨基酸，这都会使溶液的离子强度增大，促进草酸钙的溶解，使草酸钙晶体的成核与生长受到抑制。

3 结 论

在4种不同体系中形成的草酸钙晶体均存在COM，而在这4种体系中加入沙苑子提取液后，COM晶体消失，都只形成COD晶体，即沙苑子提取液对COM晶体生长具有很强的抑制作用，而COD晶体与肾小管细胞的接触程度较小、与肾小管细胞表面结合力较弱，比COM更容易随尿排出体外[13]，故沙苑子提取液有可能预防尿结石的形成。

本实验表明，沙苑子提取液对草酸钙晶体生长的抑制作用随着沙苑子提取液浓度增大，抑制作用增强。这种抑制作用除与其含有的氨基酸成分有关外，也可能与其含有的黄酮类及其它多种成分的协同作用有关，其作用机理有待进一步研究。

参与文献：

[1]Shen Y H,Yue W J,Xie A J,et al.Colloids Surf.B,2005,45:120-124

[2]Laurence M E,Levillain P,Lacour B,et al.Clin.Chim.Acta,2000,298:1-11

[3]ZHU Jun(朱 军),SHEN Yu-Hua(沈玉华),XIE An-Jian(谢安建),et al.Chem.World(Huaxue Shijie),2007,3:175-178

[4]Shen Y H,Yue W J,Xie A J,et al.Colloids Surf.,2004,234:35-41

[5]Covindaraj A,Selvam R.BJU Int,2002,90:336-339

[6]XIE An-Jian(谢安建),MA Dong(马 东),ZHU Jun(朱 军),et al.J.Anhui Univ.:Nat.Sci.(Anhui Daxue Xuebao:Ziran Kexue Ban),2007,32(2):71-74

[7]WANG Ping(王 萍),SHEN Yu-Hua(沈玉华),XIE An-Jian(谢 安 建),et al.Chinese J.Inorg Chem.(Wuji Huaxue Xuebao),2008,24(10):1604-1609

[8]CHAO Zheng-Guo(曹正国),WU Wei(吴 维),LIU Ji-Hong(刘继红),et al.Chin.J.New Drugs(Zhongguo Xinyao Zazhi),2005,14(2):166-168

[9]ZHANG Shi-Sheng(张石生),LIU Guo-Dong(刘国栋),HEJia-Yang(何家杨),et al.Chin J.Urol(Zhonghua Miniao Zazhi),1996,17(1):52-53

[10]Nenow D,Vitkov L.J.Cryst.Growth,1997,179:231-239

[11]Opalko F J,Khan S R.J.Cryst.Growth,1997,181:410-417

[12]Bretherton T,Rodgers A.J.Cryst.Growth,1998,192:448-455

[13]OUYANG Jian-Ming(欧阳健明),YAO Xiu-Qiong(姚秀琼),SU Ze-Xuan(苏泽轩),et al.Sci.China,B(Zhongguo Kexue B),2003,33(1):14-19

[14]LIU Chun-Yu(刘春宇),GU Zhen-Lun(顾振纶).Chin.Wild Plant Res.(Zhongguo Yesheng Zhiwu Ziyuan),1995,21(2):1-3

[15]ZHANG Hong-Man(张红漫),YU Wen-Tao(于文涛),OUYANG Ping-Kai(欧阳平凯),et al.Amino Acids Biotic Res.(Anjishuan He Shengwu Ziyuan),2004,26(2):62-64

[16]WANG Qiu-Ling(王秋玲),YANG Xin-Jie(杨新杰),HUANG Yong-Gang(黄永刚),et al.Mod.Trad.Chin.Med.(Xiandai Zhongyiyao),2007,27(1):65-68

[17]WANG Ping(王 萍),SHEN Yu-Hua(沈玉华),XIE An-Jian(谢安建),et al.J.Anhui Univ.:Nat.Sci.(Anhui Daxue Xuebao:Ziran Kexue Ban),2006,30(1):80-84

[18]Azoury R,Garti N,Sarig S.Urol.Res.,1986,14:295-

[19]YU Hai-Yan(于海燕),ZHANG Hui-Min(张惠敏),OUYANG Jian-Ming(欧阳健明).J.Chin.Electr.Microsc.Soc.(Dianzi Xianwei Xuebao),2007,26(2):44-48

[20]YUE Wen-Jing(岳文瑾).Thesis for the Master of Anhui University(安徽大学硕士论文).2004.

[21]Tunik L,Addadi L,Gartii N,et al.J.Cryst.Growth,1996,167(34):748-755

[22]YAO Lian-Zeng(姚连增).Basic of Crystal Growth(晶体生长基础).Hefei:University of Science and Technology of China Press,1994.

Effect of Extract of Semen Astragali Complanali on Calcium Oxalate Crystal Growth in Different Systems

WANG Ping1,2SHEN Yu-Hua＊,1XIE An-Jian1
(1School of Chemistry and Chemical Engineering,Anhui Universitry,Hefei 230039)
(2School of Pharmacy,Anhui College of Traditional Chinese Medicine,Hefei 230031)

The growth of CaC2O4crystals in the diluted urine of urinary lithiasis patients with different concentrations of Semen Astragali Complanali(SAC)extract was investigated by comparing with the crystallization in different systems such as pure water,sodium chloride aqueous solution and diluted healthy urine.The gained crystals were characterized by scanning electron microscope(SEM),Fourier transform infrared spectroscopy(FTIR)and X-ray diffraction(XRD).The results showed that calcium oxalate monohydrate(COM)crystals were the dominant phase in the diluted pathological urine,while there were only calcium oxalate dihydrate(COD)crystals after the addtion of extract of SAC in the above four systems.It indicated that SAC could prohibit the growth of calcium oxalate,and the prevention ability of SAC from the formation of COM crystals increased along with the increase of the extract concentration.The inhibition mechanism of SAC to the crystal growth of calcium oxalate was also discussed.

calcium oxalate;urinary stone;Semen Astragali Complanali;inhibition

O614.23+1；R282.7

A

1001-4861(2010)06-1089-06

2009-09-21。收修改稿日期：2010-03-12。

国家自然科学基金(No.20671001，20871001)，安徽省教育厅重大项目(No.ZD2007004-1)，高校博士点基金(No.20070357002)及安徽省功能无机材料化学重点实验室基金资助。

＊通讯联系人。E-mail：s_yuhua@163.com

王 萍，女，43岁，在职硕士研究生，讲师；研究方向：生物无机化学。