单环刺螠纤溶酶UFE-Ⅰ的性质和溶栓活性

初金鑫,蔡文娣,韩宝芹,刘万顺,陈丽梅,连 波

1潍坊医学院基础医学教学部,潍坊 261053;2中国海洋大学海洋生命学院,青岛 266003

单环刺螠纤溶酶UFE-Ⅰ的性质和溶栓活性

初金鑫1,2＊,蔡文娣1,2,韩宝芹2,刘万顺2,陈丽梅1,连 波1

1潍坊医学院基础医学教学部,潍坊 261053;2中国海洋大学海洋生命学院,青岛 266003

单环刺螠纤溶酶UFE-Ⅰ的最适反应温度为 45℃;最适反应 pH为 7.0;Mg2+、Mn2+和 Fe2+是该纤溶酶的强激活剂;Fe3+、Cu2+、Ag+、Hg+和 Pb2+对该纤溶酶具有一定的抑制作用;SBTI和 PMSF,完全抑制 UFE-Ⅰ,说明该酶为丝氨酸蛋白酶;糜蛋白酶抑制剂部分抑制UFE-Ⅰ,亮抑酶肽、抑蛋白酶肽、苯甲脒较弱的抑制 UFE-Ⅰ。与蚓激酶类似,UFE-Ⅰ不仅具有直接的纤溶活力更具有纤溶酶原激活活力(84.0%),另外分别将蚓激酶原料与该酶加入到家兔血栓块中,37℃孵育 3 h,结果表明该酶具有比蚓激酶更为强大的溶栓能力。

单环刺螠;纤溶酶;性质;溶栓活性

单环刺螠是黄渤海沿岸底栖生物的常见种[1],前人从虫体中分离到了螠速激肽Ⅰ-Ⅷ、血凝集素、腺苷三磷酸酶等生物活性物质[2-6]。单环刺螠个体肥大,肉质鲜美,体壁营养丰富[7],2006年,王佃亮等第一次从单环刺螠体腔液和内脏中分离到了纤溶酶组分[8]。潍坊拥有中国唯一的单环刺螠种质资源保护区,研究单环刺螠具有重要意义和价值,为此,潍坊医学院生物技术实验室较为详细的研究了该酶的性质并初步研究其溶栓活性。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 单环刺螠纤溶酶 UFE-Ⅰ,中国海洋大学海洋生物活性物质实验室制备;家兔,体重 2～2.5 kg,由潍坊医学院实验动物基地提供。

1.1.2 试剂与仪器:蚓激酶 (earthwor m fibrinolytic enzyme EFE),取胶囊 3粒,称其重量为 0.658 g,用生理盐水溶解,过 0.22μm的滤膜将不溶性白色药物辅料去除,上清液冷冻干燥,得 0.132 g冻干酶,以尿激酶标准品标定为 1651 U/mg,青岛国大药业有限公司;注射用尿激酶 (以尿激酶标准品标定为51226 U/mg),山东绿叶制药有限公司;尿激酶标准品 (每支含 830个单位,604-200020),中国药品生物制品检定所;;大豆胰蛋白酶抑制剂 (SBTI),上海三杰生物技术公司;纤溶酶原、凝血酶、纤维蛋白原、抑蛋白酶肽、糜蛋白抑制剂、对甲苯磺酰氟 (PMSF),美国 Sigma公司;苯甲脒、亮抑酶肽,Amresco公司;琼脂糖,德国 Serva公司;其他试剂均为国产商品试剂分析纯。AL-104电子精密天平,梅特勒-托利多仪器公司;A IR TECH超净工作台,安泰公司;XD-101倒置显微镜,南京江南光电公司。

1.1.3 家兔,由潍坊医学院实验动物基地提供。

1.2 方法

1.2.1 酶的制备

单环刺螠体腔液经硫酸铵沉淀、超滤、离子交换层析、凝胶过滤进行分离纯化,得到的单一洗脱峰酶组分,经Native-PAGE、SDS-PAGE和飞行质谱分析,确定了 UFE-Ⅰ纯度 99%以上和相对分子量为23887.23±0.28Da[9]。

1.2.2 酶活力测定

参照经典琼脂糖纤维蛋白平板法[10],并作适当改进。将尿激酶标准品配制成不同浓度的溶液点样100μL于纤维蛋白平板上的牛津杯中,37℃孵育18 h后测量溶圈互相垂直的两个直径,以两直径的乘积为纵坐标,标准酶活力为横坐标,制作标准曲线,根据标准曲线,计算UFE-Ⅰ的纤溶活力。

1.2.3 最适反应温度的测定

将加样后的纤维蛋白平板分别放入 25、30、35、40、45、50、55℃的恒温箱中,pH 7.8保温 1 h后取出,测各个溶圈的垂直直径,找出 UFE-Ⅰ作用的最适温度。

1.2.4 最适反应 pH的测定

采用 pH 2.6～12.0的广泛缓冲液[11],分别制作 pH 4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8. 5、9.0、9.5和 10.0的平板。其他条件均相同,37℃保温 18 h后取出测各平板中溶圈的垂直直径,以确定UFE-Ⅰ作用的最适 pH。

1.2.5 激活剂或抑制剂对酶活力的影响

采用几种不同的金属离子和蛋白酶抑制剂分别作用于UFE-Ⅰ,以不添加任何金属离子或蛋白酶抑制剂时的酶活力为 100%。

1.2.6 激酶活力的测定

在 80℃加热 30 min的纤维蛋白平板上,纤溶酶原失活,测得 UFE-Ⅰ的直接纤溶活力;而在标准平板上,该酶可能与被激活的纤溶酶原共同起作用,测得总活力,UFE-Ⅰ激酶活力 =总活力-直接纤溶活力。

1.2.7 体外溶栓活性的测定

试验设生理盐水空白对照组,蚓激酶 (EFE)阳性对照组,UFE-Ⅰ酶试验组,分别用生理盐水配制不同浓度的溶液。家兔静脉取血,取灭菌试管 15支分别加入新鲜血液 1.0 mL,静置待血液完全凝固,分别加入酶液 1.0 mL。每组做 3个平行样。于 37℃保温振摇,观察各试管血栓的形态颜色和溶解变化。以任何一组血块完全溶解为酶水解终点,生理盐水漂洗血栓 3次,滤纸吸去多余水分,剩余血块称重。

1.2.8 统计学方法

2 结果

2.1 最适反应温度

以琼脂糖纤维蛋白平板法测得的单环刺螠纤溶酶UFE-Ⅰ在 6种不同温度 (25、30、35、40、45、50、55℃)条件下的酶活力如图 (图 1)所示。该酶的最适反应温度约为 45℃。

图 1 温度对酶活力的影响Fig.1 Effect of temperature on the enzyme activity

2.2 酶的最适反应 pH

以琼脂糖纤维蛋白平板法测得的单环刺螠纤溶酶 UFE-Ⅰ在不同 pH(4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5和 10.0)条件下的酶活力如图(图 2)所示。从结果看,酶的最适 pH约为7.0,在 pH 6.5～7.5范围内,酶活力都很高。

图 2 pH对酶活力的影响Fig.2 Effect of pH on the enzyme activity

2.3 激活剂或抑制剂对酶活力的影响

Mg2+、Mn2+和 Fe2+离子能够显著地提高 UFE-Ⅰ活力,是该酶的强激活剂;Fe3+、Cu2+、Ag+、Hg+和 Pb2+对酶活力的具有一定的抑制作用;SBTI和PMSF完全抑制UFE-Ⅰ,说明该酶为丝氨酸蛋白酶;糜蛋白酶抑制剂部分抑制 UFE-Ⅰ,亮抑酶肽、抑蛋白酶肽、苯甲脒都较弱的抑制该酶(表 1)。

表 1 不同金属离子或抑制剂对酶活力的影响(±s,n=3)Table 1 Effecton the enzyme activity ofmetal ions or inhibitors(±s,n=3)

表 1 不同金属离子或抑制剂对酶活力的影响(±s,n=3)Table 1 Effecton the enzyme activity ofmetal ions or inhibitors(±s,n=3)

2.4 激酶活力测定

0,40,80,120,160,200为稀释后的尿激酶标准品活力单位梯度,U1,U2,U3为 0.005、0.05、0.5 mg/mL的UFE-Ⅰ溶液。得到UFE-Ⅰ纤溶活性分布见表 2。

图 3 非加热平板的纤溶活性Fig.3 Fibrinolytic ability of the non-heated plates

图 4 加热平板的纤溶活性Fig.4 Fibrinolytic ability of the heated plates

表 2 UFE-Ⅰ纤溶活性分布(±s,n=3)Table 2 Constitute of fibrinolytic activity ofUFE-Ⅰ(±s,n=3)

表 2 UFE-Ⅰ纤溶活性分布(±s,n=3)Table 2 Constitute of fibrinolytic activity ofUFE-Ⅰ(±s,n=3)

分布Constitute酶活力(U/mg) Fibrinolytic activity活力分布(%) Distribution of activity总活性Total activity 4672±57.3 100直接纤溶活性Direct fibrinolytic activity 748.3±23.6 16.0激酶活性Kinase activity 3924±57.3 84.0

2.5 两种酶不同浓度下水解血栓速度的比较

酶水解血栓 3 h后,UFE-Ⅰ组 (1 mg/mL)肉眼已看不到栓块,取出残余血块,观察下图 (图 5)可见,UFE-Ⅰ组(1 mg/mL)溶解血栓最快;其次为 EFE组(20 mg/mL)。EFE组 (2 mg/mL)栓块的质量出现增加的现象,可能是 EFE使栓块膨松后吸水的结果。残余血栓称重结果见表(表 3)[9],表明 UFE-Ⅰ有强大的溶栓作用。

图 5 血栓溶解实验中残留的血栓Fig.5 The remained rabbit thrombuses after thrombolytic test

表 3 残余血栓的质量(±s,n=3)Table 3 Mass of the remained thrombuses(±s,n=3)

表 3 残余血栓的质量(±s,n=3)Table 3 Mass of the remained thrombuses(±s,n=3)

组别Group剂量Dose(mg/mL)残余栓块质量(g) Thrombusesmass(g) Control - 0.508±0.006 UFE-Ⅰ 1 0.001±0.000＊#

＊P＜0.01,vs control;#P＜0.05,vs EFE(20 mg/mL)

3 讨论

UFE-Ⅰ作为一种新型的纤溶酶具有以下的性质特点:最适反应温度为 45℃;最适反应 pH为7.0;Mg2+、Mn2+和 Fe2+离子能够显著地提高该酶活力,是 UFE-Ⅰ的强激活剂;Fe3+、Cu2+、Ag+、Hg+和 Pb2+对酶活力的具有一定的抑制作用;SBTI和PMSF均为丝氨酸蛋白酶抑制剂,完全抑制UFE-Ⅰ,说明该酶为丝氨酸蛋白酶;糜蛋白酶抑制剂部分抑制UFE-Ⅰ,亮抑酶肽、抑蛋白酶肽、苯甲脒都是类胰蛋白酶的抑制剂,且不抑制糜蛋白酶[12],它们均较弱的抑制 UFE-Ⅰ,说明 UFE-Ⅰ有较强的类糜蛋白酶活性和较弱的类胰蛋白酶活性。作用于底物时,可能更易于作用于芳香环侧链氨基酸的羧基肽键; UFE-Ⅰ主要具有纤溶酶原激活活性 (84.0%),而直接水解纤维蛋白的活性比较弱(16.0%)。

另外UFE-Ⅰ具有强大的溶解家兔栓块的能力,强于 20倍的蚓激酶原料。海洋无脊椎动物单环刺螠资源丰富,且可望通过人工方法进行规模化养殖。因此,开展单环刺螠纤溶酶的研究,探讨其医用价值,不仅对开发海洋生物新药提供新思路新资源,同时对海洋经济的发展也起到积极的推动作用。

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Characterization and Thrombolysis Activity of Fibrinolytic Enzyme UFE-I fromU rechis unicinctus

CHU Jin-xin1,2＊,CA IWen-di1,2,HAN Bao-qin2,L IU Wan-shun2,CHEN Li-mei1,L IAN Bo1

1Departm ent of Preclinical m edicine,W eifang M edical College,W eifang,261053,China;2College of M arine Life Sciences,Ocean University of China,Q ingdao,266003,China

The optimum temperature ofUFE-Ⅰwas about 45℃.The optimum pH was about 7.0.Itwas discovered that Fe3+、Cu2+、Ag+、Hg+and Pb2+ionswere inhibitors ofUFE-Ⅰ,andMg2+、Mn2+and Fe2+ionswere activators of this enzyme.SBTI(soybean trypsin inhibitor)and PMSF(pheny lmethyl sulfonylfluoride)completely inhibited UFE-Ⅰ, which indicated that the enzyme belonged to serine protease group,chymotrypsin inhibitor fractionaly inhibited UFE-Ⅰ, leupeptin、aprotinin and benzamidine inhibited UFE-Ⅰweakly.Like lumbrokinase,UFE-Ⅰcan not only directly degrade fibrin but also indirectly hydrolyze fibrin through transfor ming plasminogen into plas min(84.0%).when each enzyme and rabbit thrombuswas incubated at 37℃ for 3 h.The results showed that UFE-Ⅰhad stronger thrombolytic ability than lumbrokinase.

U rechis unicinctus;fibrinolytic enzyme;characterization;thrombolysis activity

Q503

A

1001-6880(2010)04-0661-04

2009-11-12 接受日期:2010-01-15

＊通讯作者 Tel:86-536-8462052;E-mail:jxchu_81@yahoo.com