48种中药材的多种提取方法的提取物抑制内皮细胞和癌细胞增殖的活性研究

陈 龙,刘英学,陈少鹏,陆 鑫,成 浩,宋少江,周国春＊

1沈阳药科大学中药学院,沈阳 110016;2中国科学院广州生物医药与健康研究院,广州 510663

48种中药材的多种提取方法的提取物抑制内皮细胞和癌细胞增殖的活性研究

陈 龙1,2,刘英学2,陈少鹏2,陆 鑫2,成 浩2,宋少江1,周国春2＊

1沈阳药科大学中药学院,沈阳 110016;2中国科学院广州生物医药与健康研究院,广州 510663

采用石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯、甲醇、乙醇、水为溶剂顺序或单独提取及热水提取药材,研究这些提取物对 HUVEC、Bel-7402、A549细胞增殖的抑制活性,筛选具有抑制内皮细胞和癌细胞增殖活性的药材及其提取方法。本文所研究的 48种中药材的不同提取方法的提取物抑制内皮细胞和癌细胞增殖的活性结果表明:41种中药材都具有一定的抗血管生成和/或抗癌细胞活性,其中对 HUVEC、Bel-7402和A549细胞增殖明显抑制活性 (IC50≤10μg/mL)的药材分别有 22种、6种和 6种,对 3种细胞的增殖都有明显抑制活性 (IC50≤10μg/mL)的药材有 5种。

中药材;抑制细胞增殖;HUVEC;Bel-7402;A-549

无限制增殖是癌细胞的最基本的特点[1],而无节制激活血管生成作用是癌细胞获得营养和氧气实现癌症发展及转移的主要病理因素[1-3],因此有效抑制癌细胞增殖和阻断肿瘤血管生成作用是抗癌的 2个主要策略。包括中草药在内的动植物和微生物等是抗癌药物的重要来源,目前临床使用的许多抗癌药物是天然产物或其类似物[4-6]。中草药在我国有悠久的历史,最近几十年里我国中医药工作者已经将许多中草药开发成为抗癌中草药而用于各种癌症治疗,这些成果为中草药在抗癌领域的研究做出了重要贡献。

为了研究中草药成分 (物质基础)与药理药效活性之间的关系,本文对多个科属的 48种中药材进行了多种提取方法提取,筛选研究了这些提取物的抗癌细胞增殖及抗内皮细胞增殖的活性。本研究目的是:1)在细胞水平评价这些中药材是否具有抗癌细胞和抗血管生成活性;2)确定它们的活性成分所在的提取部位。这项研究为我们将来从中草药中发现抗癌活性成分并研究开发以中草药为源头的抗癌药物提供实验基础。

1 材料

1.1 药材

本文所用 48种中药材(TCMs)均购自广州市同仁堂药业五羊店,都有明确的省县(市)产地记录。

1.2 细胞

激活内皮细胞增殖是血管生成的最重要的环节[2,3],本文所用的内皮细胞是人脐带静脉内皮细胞(HUVEC),HUVEC由中国科学院广州生物医药与健康研究院周国春实验室从新鲜人脐带中原代分离、传代培养,药物筛选所用细胞为 3～8代 HUVEC;人非小细胞肺癌细胞A549来源于ATCC(http://www.atcc.org),由中国科学院广州生物医药与健康研究院裴端卿实验室保存;人肝癌细胞 Bel-7402购自武汉大学细胞典藏中心,由中国科学院广州生物医药与健康研究院周国春实验室保存。

1.3 试剂

石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯和乙醇或甲醇等均购自广东省西陇化工有限公司;DMSO购自 Sigma; MTT购自 AMRESCO;RPM I-1640、DMEM/H IGH GLUCO购自 Hyclone;EG M-2购自 LONZA (cc-3162);小牛血清购自 G IBCO。

阳性药物:A549细胞增殖阳性抑制药物紫杉醇(Taxol)购自福建南方生物技术股份有限公司;Bel-7402细胞增殖阳性抑制药物多柔比星 (阿霉素/ ADM)购自广东省药品检验所;HUVEC细胞增殖阳性抑制药物 TNP470为中国科学院广州生物医药与健康研究院周国春实验室合成。

1.4 仪器

粉碎机(温岭林大,DFT-200);旋转蒸发仪 (广州予华,RE-5299);低温冷却液循环泵 (广州予华, DLSB-5L/25);冷冻干燥机 (广州正仪,FD-1D-80);超级酶标仪 (美国,B IO-TEK);二氧化碳培养箱(Thermo);超净工作台(Thermo)。

2 方法

2.1 药材提取方法

将药材用粉碎机粉碎后按以下方法提取 (括号内为提取方法的缩写,以下同此缩写)。

顺序提取:称取 40 g粉碎药材依次用 8倍体积量(～320 mL)溶剂石油醚(P)、二氯甲烷(D)、乙酸乙酯(E)、甲醇 (M)和水 (W)室温浸提 3次,24 h/次,室温减压回收溶剂或冻干得待测样品。

水热提:称取 40 g粉碎药材用 8倍体积量 (～320 mL)水(H)100℃提取 3次,提取时间分别为 3、2和 1 h,60℃减压蒸去大部分水后冻干得待测样品。

单独提取:称取 40 g粉碎药材单独用 8倍体积量(～320 mL)乙醇 (N)或二氯甲烷 (d)提取 3次, 24 h/次,减压回收溶剂得待测样品。

2.2 活性筛选方法

2.2.1 细胞培养及药物处理

A549和Bel-7402细胞的培养液是含 10%小牛血清的 RPM I-1640,HUVEC细胞培养液是 EG M-2 (含生长因子),细胞在 37℃,5%CO2条件下维持培养。

按A549细胞、Bel-7402细胞每孔 1500个细胞接种于 96孔板,HUVEC细胞为每孔 1000个细胞接种于 96孔板,待细胞贴壁后加入药物 (药物先用DMSO溶解,加药前用 PBS稀释),溶剂对照组和加药组(包括阳性药物)的细胞培养液中 DMSO终浓度均为 0.1%,每个浓度有 3个复孔。

2.2.2 MTT检测

加药再继续培养 96 h后,每孔加入 20μL MTT (5.0 mg/mL),再在 37℃,5%CO2条件下继续孵育4 h,然后吸去细胞培养液,每孔加入 100μL DMSO分析纯试剂溶解 MTT被还原的产物-蓝紫色For mazan结晶,并于超级酶标仪 570 nm下读数。超级酶标仪读数是 For mazan的吸光度值 (OD570),其反映活细胞的还原酶活力与细胞的活力成正比,因此基于溶剂对照组和加药组吸光度值可以计算出阳性药物(表 1)和各个提取物的 I C50(表 2)。

3 结果

3.1 药物筛选结果

HUVEC、Bel-7402和 A-549的阳性药物的活性见表 1。41种中药材的多种提取物 (至少一种提取物)对 HUVEC、Bel-7402和 A-549细胞增殖有抑制活性,表 2列出了它们的活性结果 IC50,为了便于对照,我们还列举了这些药材文献报道[7-9]的主要化学成分类别。

表 1 阳性药物抑制细胞增殖的活性结果 (IC50)Table 1 Activity data(IC50)for positive compounds against corresponding cell proliferation

顺序提取的所有提取物对 3种细胞都没有抑制活性 (IC50≥50μg/mL)的药材是:石韦 (Folium Pynosiae)、卷柏(Herba Selaginellae)、马鞭草(HerbaVerbenae)、急性子(Sem en Im patientis)、侧柏叶(Cacum en Platycladi)、牛膝(Radix Achyranthis B identatae)和赤芍(Radix Paeoniae Rubra)。

表 2 41种中药材提取物抑制细胞增殖的活性结果 (I C50)及文献报道的主要化学成分Table 2 Activity data(IC50)for 41 TCMs’extracts against cell proliferation of HUVEC,Bel-7402 and A549 and these TCMs’major constituents reported in literatures

注:a所有提取物对 3种细胞都没有活性的药材未列在此表中;b除指定外,所有药材均进行了顺序提取;c对 3种细胞都没有抑制活性的系列提取物未列在此表中;d只进行指定溶剂的单独提取;“–”表示无活性 (IC50≥50μg/mL)。Notes:aTCMs without activity against all three cells were not included in the table;ball listed TCMswere conducted by sequential extraction unless designated;cthe extractwithout any inhibitory activity to three cellswas not listed in the table;dextracted onlywith designated solvent;“–”means“I C50≥50μg/mL”.

分析上述不同提取方法的提取物的活性结果可以发现,活性成分被二氯甲烷 (D或 d)提取的几率较大,其次是乙酸乙酯 (E)及石油醚 (P);而活性成分被大极性溶剂如甲醇 (M)、乙醇 (N)和水 (W或H)的提取效率相对较低。

3.2 对 HUVEC增殖有明显活性 (IC50≤10μg/ mL)的中药材共 22种

按文献报道药材所含的成分分类 (括号内为提取方法的缩写):1)含有醌类结构的药材为瞿麦(N)、紫草(P、E、D)、茜草 (D、E);2)含有黄酮及木质素类结构的药材为仙鹤草 (P)、小蓟 (N)、路路通(P、D)、凌霄花(E)、鸡冠花 (D)、槐米 (E、D)、蒲黄(D、P、M)、艾叶 (N)、降香 (E、H、D)、苏木 (D、H、M、E)、一点血(D)、黄芩(D、E);3)含有酚类结构的药材为仙鹤草(P)、矮地茶 (D)、小蓟(N)、降香 (E、H、D);4)含氮类化合物的药材为马齿苋 (W)、马勃(D)、一点血(D);5)菲、蒽、萘类化合物的药材为紫草(P、E、D)、白及 (D、E)、茜草 (D、E);6)甾体、萜类化合物的药材为马齿苋 (W)、马勃 (D)、路路通(P、D)、凌霄花(E)、槐米 (E、D)、艾叶 (N)、九里香(D)、鸡血藤(d)、紫草(P、E、D)、穿山龙 (E、M、D)、茜草(D、E);7)含有香豆素结构的药材为矮地茶(D)、九里香(D)。

3.3 对 Bel-7402增殖有明显活性 (IC50≤10μg/ mL)的中药材共 6种

按文献报道药材所含的成分分类 (括号内为提取方法的缩写):1)含有醌类结构的药材为紫草 (P、D)、茜草(D);2)含有黄酮及木质素类结构的药材为蒲黄 (D)、降香(H)、茜草 (D)、黄芩 (D);3)含有酚类结构的药材为降香 (H);4)菲、蒽、萘类化合物的药材为紫草 (P、D)、茜草 (D);5)甾体、萜类化合物的药材为紫草 (P、D)、穿山龙 (E)、茜草 (D);6)含有氮类化合物的药材为茜草(D)。

3.4 对A-549增殖有明显活性 (I C50≤10μg/mL)的中药材共 6种

按文献报道药材所含的成分分类 (括号内为提取方法的缩写):1)含有醌类结构的药材为紫草(P)、茜草 (D、E);2)含有黄酮及木质素类结构的药材为蒲黄(D)、降香(E、D)、苏木 (E)、茜草 (D、E); 3)含有酚类结构的药材为降香 (E、D);4)是菲、蒽、萘类化合物的药材为紫草 (P)、茜草 (D、E);5)甾体、萜类类化合物的药材为紫草 (P)、穿山龙 (E、 M)、茜草(D、E)。

4 讨论

本次研究共筛选了分属于多个科属的 48种中药材,除 7种中药材外其余的 41种中药材都具有一定的抗血管生成和/或抗癌细胞活性,其中有些中药材的同一提取物对 2种或以上细胞有增殖抑制活性,对 3种细胞的增殖均有明显抑制活性 (IC50≤10 μg/mL)的药材有 5种。另一方面,活性筛选结果发现同一药材不同提取方法得到的提取物活性差异很大,因此有效的提取方法和合理的分配原则可能可以将一些没有活性的成分排除在外使得有活性的成分能够得到富集。这些初步研究结果不仅对从中草药中寻找抑制内皮细胞增殖和抗癌细胞增殖活性的药物研究打下基础,而且为将来进一步研究各种不同成分之间药理药效活性的相互依存、相互促进、相互拮抗等关系提供了基本实验依据。

1 Hanahan D,Weinberg RA.The hallmarks of cancer.Cell, 2000,100:57-70.

2 Folkman J.Tumor angiogenesis:therapeutic implications.N Engl J M ed,1971,285:1182-1186.

3 Folkman J.Angiogenesis:an organizing principle for drug discovery.Nat Rev D rug D iscov,2007,6:273-286..

4 Newman DJ.Natural products as leads to potential drugs:an old processor the new hope for drug discovery.J M ed Chem, 2008,51:2589-2599.

5 Newman DJ,Cragg G M.Natural products as sources of new drugs over the last 25 years.J Nat Prod,2007,70:461-477.

6 Newman DJ,Cragg G M.Natural products from marine invertebrates and microbes as modulators of antitumor targets.CurrD rug Targets,2006,7:279-304.

7 Edited by Nanjing University of Chinese Medicine(南京中医药大学编),The Dictionary of Traditional Chinese Medicines(中药大辞典),Shanghai:Shanghai Scientific&Technical Publishers,2006.

8 Gao XM(高学敏),Xu Z M(许占民),Li Z W(李钟文),et al.ChineseMedicines(中药学).Beijing:People’sMedical Publishing House,2000.

9 Xiao CH(肖崇厚).Chemistry of Chinese Medicines(中药化学).Shanghai:Shanghai Scientific&Technical Publishers,1987.

CHEN Long1,2,L IU Ying-xue2,CHEN Shao-peng2,LU Xin2,CHENG Hao2,SONG Shao-jiang1,ZHOU Guo-chun2＊

1School of Traditional Chinese Materia M edica,Shenyang Pha rmaceuticalUniversity, Shenyang 110016,China;2Guangzhou Institute of B iom edicine and Health,Guangzhou 510663,China

Antiproliferative Inhibition of Endothelial Cell and Cancer Cells by D ifferent Extracts of 48 Traditional Chinese M edicines

Sequential extraction or individual extraction of 48 Traditional Chinese Medicines(TCMs)by petroleum ether,dichloromethane,ethyl acetate,methanol,ethanol,water or boilingwaterwas conducted and antiproliferative activity of these extracts againstHUVEC,Bel-7402 and A549 proliferation was assayed.The results in this report showed that 41 of 48 studied TCMs expressed antiproliferative activity to HUVEC or/and cancer cells,in which 22,6 and 6 studied TCMs exhibited good inhibition(IC50≤10μg/mL)to the proliferation of HUVEC,Bel-7402 and A549,respectively,and 5 studied TCMs behaved good inhibitory activity(IC50≤10μg/mL)to all three cells’proliferation.

Traditional ChineseMedicine(TCM);antiproliferative activity;HUVEC;Bel-7402;A-549

R282.7/05;Q946.91

A

1001-6880(2010)04-0692-05

2009-06-22 接受日期:2009-09-15

中国科学院人口健康与医药创新基地重要方向项目(KSCX-2-Y W-R-22);广东省中医药局项目(2007202)

＊通讯作者 Tel:86-20-32290487;E-mail:zhou guochun@gibh.ac.cn