高效液相色谱法测定雷帕霉含量

齐 利 河南省安阳市食品药品检验所（455000）

高效液相色谱法测定雷帕霉含量

齐 利 河南省安阳市食品药品检验所（455000）

详述了一种建立高效液相色谱法测定局部组织中雷帕霉素含量的实验方法，该方法操作简单，重现性好，为进一步研究局部应用雷帕霉素抑制血管再狭窄提供保障。

高效液相色谱法；雷帕霉素；药物含量

雷帕霉素是一种内酯类抗生素，具有抑制血管平滑肌增殖、抑制血管内膜增生的作用。雷帕霉素涂层支架技术在预防介入治疗后冠脉再狭窄上已取得了明显的效果；并且，也有研究发现血管周围局部应用雷帕霉素也能抑制冠脉搭桥术后桥静脉的再狭窄。以上均为药物的局部应用。且已成为目前的研究热点。本实验拟在建立高效液相色谱法测定局部组织中雷帕霉素含量的方法，用于研究其局部药代动力学。

1 试剂仪器与实验动物

1.1 仪器 Agilent 1100系列高效液相色谱系统(美国)：三元梯度，微量标准自动进样器，紫外一可见监测器，柱温样品温控：Startorious1712型电子天平(德国)；XW一80A涡旋混合器；TGL-16B台式离心机。

1.2 试剂 甲醇、乙腈为色谱纯；硫酸锌、丙酮、乙醚、正己烷为分析纯；水为超纯水。雷帕霉素对照品（纯度：99.4%，高效液相色谱法测定）。

1.3 动物普通级封闭群 大耳白兔，体重2.5～3.0kg。

1.4 方法与结果

1.4.1 色谱条件色谱柱 为Alltech C18(250mm×4.6mm，5μ m)，预柱：Alltech C18(7.5mm×4.6mm，5μm)。流动相为乙腈：四氢呋喃：水(55:5:40)；检测波长：278nm，流速为1.2ml/min，柱温60℃。

1.4.2 标准曲线的绘制 取兔正常颈外静脉、组织匀浆，方法同上。分装于EP管中，置-20℃冰箱中。空白血管样本匀浆液保存备用。分别配制雷帕霉素溶液6.4、3.2、1.6、0.8～0.4、0.2ug/ml，各取10ul于离心管中分别加人空白m管样本匀浆液0.5ml，充分混匀后，构成标准组织浓度为128、64、32、16、8、4ng/ml。22℃水浴5min，用N2吹干醚层，加150ul流动相于试管中，密塞，涡旋混匀15min，加500ul正己烷于试管中，涡旋混匀30s.8000xg离心10min，吸弃上层正己烷，下层溶液置22℃水浴中，用N2吹去残留的正己烷及部分丙酮，至总容量为2ml，取100ul进样测定。

1.4.3 样品溶液的制备 手术取兔的一侧颈外静脉，长约3cm，于其周围涂布携0.3mg雷帕霉素的Pluronic F-127凝胶。术后1、2、4、8周取材。去除3cm血管的两端，取其中段，收集标本。剥除血管周围脂肪组织，生理盐水冲洗至无残留血液，滤纸吸干表面液体。称重2g，眼科剪剪碎，加人1ml丙酮予以匀浆。匀浆液3500xg离心10min，按1.4.2项操作后，进样100ul作高效液相色谱法分析。

2 结果

2.1 色谱条件及方式 本色谱条件下，样品检测均未发现有对雷帕霉素的干扰峰。以雷帕霉素峰面积A为纵坐标，药物浓度C为横坐标进行线性回归。回归方程为：A=3.2481C+7.4082× 10-3,r=0.9925。在4～128ng/ml范围内线性良好。

2.2 精密度试验 吸取同一对照品溶液，在上述色谱条件下重复进样5次，记录色谱峰面积，雷帕霉素峰面积RSD值为0.54%。

2.3 重复性试验 精密称取雷帕霉素5份，每份1mg，制备样品溶液，在上述色谱条件下进行高效液相色谱法分析，雷帕霉素含量RSD为1.9%。

2.4 样品测定 据回归方程，计算出药物浓度(表1)。可见血管外涂携雷帕霉素的Pluronic F-127凝胶，血管组织内药物含量随时间递减，但在8周内仍可有一定剂量的药物残留。

表1 血管组织内药物含量

3 讨论

3.1 色谱柱的选择 笔者多次对不同的色谱柱进行试验，发现色谱柱Alltech C18(250mm×4.6mm，5μm)对雷帕霉素药物浓度检测的灵敏度较高，波形较好，故选择此柱。同时，考虑到生物组织匀浆样品中杂质较多，为延长色谱柱的使用寿命，使用了预柱AIItech C18 (7.5mm×4.6mm。5μm)。

3.2 检测波长的选择 将配制的雷帕霉素溶液，用紫外波长190～400nm扫描，发现雷帕霉素在278nm时有最大的吸收峰。故选择265nm作为检测波长。

3.3 流动相的选择 在对流动相体系进行摸索的过程中，发现流动相中有机溶剂的比例对分析结果有的影响。选择乙腈：四氢呋喃：水（55:5:40）为流动相，杂质峰对样品峰干扰小，保留时间适宜。

3.4 流速和柱温的选择 流速和柱温影响着雷帕霉素的洗脱开寸间及波形，较高的流速和较高的柱温可以使洗脱时问更短波形较好。但过高的流速会增加整个色谱系统的压力，过高的温度会损坏色谱柱及其它关键元器件。经过摸索，选择流速1.2ml/min，柱温60℃。

3.5 样品的预处理 雷帕霉素的血药浓度的高效液相色谱法检测已经有了比较成熟的方法 。在对血管的预处理时。笔者在血样预处理方法的基础上加入了切碎和匀浆，并在匀浆中加人了1ml丙酮，以加大对血管壁内雷帕霉素的回收。结果表明：检测方法满意。

本法操作简单，重现性好，可用于测定局部血管组织中雷帕霉素含量，研究其药代动力学和组织分布,为进一步研究局部应用雷帕霉素抑制血管再狭窄提供保障。

10.3969/j.issn.1672-2779.2010.18.174

1672-2779（2010）-18-0238-02

2010-06-15）