细胞移植及软骨组织工程技术在关节软骨损伤临床应用进展

林桢 郑秋坚 郑铭豪

·综述·

细胞移植及软骨组织工程技术在关节软骨损伤临床应用进展

林桢 郑秋坚 郑铭豪

细胞移植和软骨组织工程技术是治疗关节软骨损伤的新方法，也是当今国内外关节骨科的研究热点。本文综述了国际上各种细胞移植和组织工程技术在关节软骨损伤临床的应用，包括软骨细胞移植技术、联合组织工程支架的软骨细胞移植技术和干细胞移植技术，着重介绍了各种技术的特点和临床应用现状及进展，以期为国内软骨损伤治疗技术选择提供思路。

细胞移植; 软骨修复; 组织工程; 软骨细胞

关节软骨损伤是临床常见的骨科疾病，由于关节软骨本身缺乏修复机制，在损伤后难以恢复原有的组织结构，因此在治疗上存在很大困难。软骨在损伤后暴露软骨下骨的血管、神经，引起关节疼痛及部分关节功能障碍，进一步发展成骨性关节炎，最后患者不得不接受人工关节置换。多年来，科学家们不断地研发探讨关节损伤的治疗方案，希望能够修复损伤的关节软骨组织。传统的软骨修复方法主要是微骨折术或软骨下骨钻孔，术后软骨下骨骨髓腔内的干细胞渗透到软骨损伤部位，启动软骨修复机制。但是这种干细胞的渗透缺乏足够有效的引导，修复形成纤维软骨为主的混合组织，无法恢复关节软骨本身的组织结构，临床效果并不理想。近年来，由于组织工程技术的发展，关节损伤修复的治疗有了许多突破。特别是以细胞治疗为主的组织工程技术，给关节损伤患者提供了更多的机会。现将国际上与细胞治疗有关的软骨组织工程技术修复关节软骨损伤的临床现状和进展介绍如下。

1 软骨细胞移植技术

1.1 自体软骨细胞移植技术

自体软骨细胞移植(autologous chondrocyte implantation/transplantation，ACI/ACT)技术在1987年由一名瑞典医生首次在临床上应用于软骨损伤修复。该技术主要包括三方面内容:(1)通过关节镜检查，检查并确诊缺损部位后，从患者关节非负重区采取一小片关节软骨，在无菌条件下送到细胞培养室;(2)应用酶消化等方法分离软骨细胞，在体外加入软骨细胞培养基及动物血清进行增殖培养，以获取足够数量的细胞;(3)通过开放手术暴露关节损伤部位，修整创口，将含有一定数量的软骨细胞悬液注射到创面，然后用自体骨膜或胶原蛋白膜覆盖并缝合。该技术为第一代的组织工程化软骨技术。

多个临床随访研究证明，ACI修复非感染性关节软骨缺损的早期疗效较为满意。1994年首个临床随访报道，23例髋关节软骨损伤患者经过ACI治疗，结果87%达到优良，活组织病理学检查发现其中73%的患者呈现透明样软骨生成［1］。2001年，该作者报道了ACI治疗213例髋关节股骨端不同程度损伤的患者2～10年随访结果，有84%～90%的患者效果达到良好或优秀［2］。1997年，美国食品药品管理局通过了ACI的临床准入申请，并进行了一项多中心临床应用研究，有19个医疗中心的50例膝关节软骨损伤患者接受了ACI治疗，患者平均年龄为36岁，关节软骨缺损评估Ⅲ～Ⅳ度，平均缺损面积为4.2 cm2，经过3年以上随访，手术成功率达94%［3］。另外，不同损伤部位的比较研究发现，ACI对髌股关节面的修复效果较差，这可能与髌骨运动轨迹紊乱影响关节面软骨修复有关［4］。

Bentley等［5］对100例膝关节软骨损伤患者进行ACI(58例)与骨－软骨移植(42例)的前瞻性临床随机对照研究，患者平均年龄为31.2岁，平均软骨缺损面积为4.66 cm2，结果ACI技术的优良率为88%，而骨－软骨移植的优良率为69%，其中5例用骨－软骨移植治疗髌骨关节面缺损者均失败。他们认为ACI明显优于骨－软骨移植。

但是，也有报道显示ACI的返修率高达15%～30%［6］，说明该技术仍存在一定的缺点。首先，骨膜肿胀是最常见的术后并发症，由此引起患者术后康复效果不良、关节疼痛不缓解等。再次，研究证明，软骨细胞在体外增殖的过程中发生去分化，软骨细胞表型向成纤维细胞转变，透明软骨基质的主要成分Ⅱ型胶原蛋白基因表达减少，而纤维软骨的主要成分Ⅰ型胶原纤维基因表达增加［7］。细胞在机体外表型的改变，可能影响细胞移植到体内分泌软骨基质的功能，从而影响修复效果。最后，全层关节软骨缺损部位通常具有一定的厚度，传统ACI技术单纯使用软骨细胞悬液注射，无法保证三维结构的完整填充和构建。

1.2 同种异体软骨细胞移植技术

实验表明，软骨基质的抗原性很低，同种异体的软骨细胞在基质的保护下仅能引起轻微的免疫反应［8］。因此，有人提出了用同种异体的软骨细胞作为软骨缺损修复的种子细胞，可制成现成的组织工程化软骨产品。

DeNovo ET技术(Zimmer Inc，荷兰;IN/ISTO Technologies Inc，美国)利用胚胎来源的软骨细胞，在体外经过增殖培养后，结合具有生物相容性的软骨引导/诱导基质，用于软骨缺损修复［9］。实验证明，来自新生儿或胚胎的软骨细胞较成人软骨细胞更能有效地生成Ⅱ型胶原蛋白和蛋白聚糖等软骨基质，有利于软骨修复［10］。该技术利用胚胎软骨细胞，制成现成的软骨修复产品，将可望用于一期手术治疗，但目前还处于临床前期试验阶段。

随后，该公司又推出了DeNovo NT技术，结合软骨碎片技术和同种异体胚胎软骨组织的概念，在无菌条件下将来源于胚胎的软骨组织切碎，平铺到软骨缺损区，利用纤维胶固定。由于该技术无需添加任何未经许可的生物材料、组织消化酶或细胞培养基，因而无需通过美国食品药品管理局的市场前期认证，已经有超过70例的患者接受治疗［11］。

另外还有人提出建立软骨组织库，从新鲜尸体上获得软骨组织，在体外分离细胞，经培养后置于低温保护液及液氮内可保存较长时间［12-13］。在需要时，可对细胞进行复苏，结合组织工程技术用于软骨损伤的一期治疗［9］。Almqvist等［14］报道了运用成人异体软骨细胞结合藻酸盐载体治疗21例膝关节软骨损伤患者的结果，证明了该技术的可行性和安全性。该方法可解决软骨组织来源稀少的问题，但在伦理学审核及潜在疾病传染等问题上仍需谨慎考虑。

2 联合组织工程支架的软骨细胞移植技术

为了克服第一代ACI技术存在的诸多缺点，科学家们以建立三维的软骨样组织为出发点，结合软骨细胞及各种组织工程支架构建组织工程化软骨。利用生物材料作为软骨细胞体外培养和体内填充的临时载体，除了可以用于修复缺损软骨的三维结构之外，还能支持细胞的生长、扩增和分化。实验证明，在三维结构中培养有利于保持软骨细胞的生物表型，克服其在二维平面培养过程的去分化［15］。

组织工程生物支架开发是第二代软骨细胞移植的核心技术，目前正引起国内外广泛的关注。为了寻找修复软骨损伤最佳的生物支架，开发安全有效的第二代软骨细胞移植技术，研究者开展了大量的动物实验和临床研究。目前，已经投入到临床应用的主要有下列几种产品，见表1。

表1 软骨细胞结合组织工程支架的商业化产品及技术特点

2.1 基质诱导的自体软骨细胞移植

基质诱导的自体软骨细胞移植(matrix-induced autologous chondrocyte implantation，MACI®)技术由德国Verigen公司开发，后由美国Genzyme公司收购，在美国、澳大利亚及欧洲多个国家临床应用，全球治疗关节软骨损伤患者超过5000例，是目前临床应用最为广泛的第二代软骨细胞移植技术。该技术主要采用Ⅰ/Ⅲ型胶原蛋白生物膜作为细胞支架。该生物膜具有双层结构，粗糙面的纤维排列较为稀疏，供软骨细胞粘附、生长、迁徙，及营养渗透;光滑面纤维结构较致密，植入时面向关节腔，修复关节软骨的光滑表面。结合关节镜技术，把细胞－生物膜复合物覆盖到软骨缺损区域，然后用纤维生物胶(fibrin glue)固定。该技术利用生物膜代替骨膜，减少了缝合步骤，结合关节镜技术，有效缩短了手术时间，减少手术创伤。Ⅰ/Ⅲ型胶原蛋白膜为软骨细胞提供了合适的生长微环境，避免细胞去分化，保持较好的软骨细胞表型［16］。另外，纤维生物胶除了作为生物膜与基底的粘合剂之外，还可以促进软骨细胞的蛋白基质分泌和迁移［17］。

Cherubino等［18］在2003年率先报道了MACI®后6个月的短期随访结果，显示MACI®治疗可明显改善患者关节功能，MRI检查提示透明样软骨修复，同时未发现任何术后并发症。Bartlett等［19］报道6个月到1年的随访结果也证实MACI®可有效修复膝关节全层骨软骨缺损。12例患者3年随访结果提示中期MACI®治疗效果良好［16］。术后并发症包括植入物增生、脱落，以及关节僵硬等［20-21］。

ACI与MACI®的前瞻性随机对照研究发现，ACI组(44例)患者术后优良率为79.2%，MACI®组(47例)为66.6%;在术后1年组织学检查为透明样软骨或透明样软骨与纤维软骨混合组织分别为ACI组43.9%和MACI®组36.4%;术后并发组织增生ACI组有9%，MACI®组有6%;两组的返修率均为9%［20］。MACI®组与微骨折组术后2年MRI复查提示MACI®能够较好地修复和填充软骨缺损区域，临床功能恢复评价也较微骨折组好［22］。

2.2 Hyalograft®C

Hyalograft®C是一种基于以透明质酸为主要成分的生物支架的组织工程化软骨产品。透明质酸是关节透明软骨基质中的主要蛋白成分。许多研究证明透明质酸可以支持软骨细胞分化，促进细胞Ⅱ型胶原蛋白及蛋白聚糖基因表达，同时促进细胞增殖［23-25］。Hyalograft®C采用HYAFF®11(Fidia Advanced Biopolymers Laboratories，意大利)作为软骨细胞载体。该材料的主要成分为透明质酸苄酯，由20μm粗的纤维组成孔隙结构，可有效支持细胞聚集生长，维持软骨细胞表型，促进细胞间通讯和细胞基质沉积［24，26］。

临床研究结果表明，Hyalograft®C治疗的软骨损伤患者，生活质量提高率达94%，关节功能提高率为87%，修复组织呈透明样软骨［27］。Gobbi等［28］报道了Hyalograft®C治疗髌股关节全层软骨损伤的临床应用结果，共34例患者5年随访期限，平均软骨损伤面积4.45 cm2，术前国际软骨修复协会(International Cartilage Repair Society，ICRS)评分Ⅲ～Ⅳ级。术后5年91.7%的患者关节功能主观评分达到正常或接近正常水平。其中有8例患者接受术后关节镜复查，组织学检查提示透明样软骨修复。

除了用于治疗关节软骨局限性损伤之外，还有报道提示Hyalograft®C可能用于治疗早期慢性骨关节软骨退行性变。Nehrer等［29］进行了一项为期3年的随访研究，36例慢性膝关节损伤患者在术后1年关节功能即可改善。其中单个损伤患者功能恢复情况明显优于多个损伤者，对年轻患者的治疗效果也较好。最近，还有文献报道了应用Hyalograft®C技术治疗大面积软骨缺损的临床病例。1例17岁急性白血病患者经过大剂量激素治疗后出现股骨远端和胫骨近端缺血性坏死。关节镜探查发现软骨下骨塌陷，内侧股骨髁软骨损伤面积达14 cm2。一期手术钻孔减压并取部分软骨组织做体外增殖培养。5个月后行二期手术，对损伤关节面行Hyalograft®C修复。术后随访5.5年，患者膝关节症状明显改善，可进行日常活动及适量运动，MRI检查显示内侧股骨髁关节软骨牢固［30］。Hyalograft®C技术术后并发症包括组织增生(2例)、关节僵硬(1例)和滑膜炎(1例)［31］。

2.3 Bioseed®-C

Bioseed®-C通过从患者身上分离软骨细胞，培养增殖后与改良的纤维蛋白凝胶混合，用于治疗关节软骨损伤，或与角质细胞混合治疗皮肤创伤。

纤维蛋白来源于血液中，一般情况下纤维蛋白原呈液态存在，经激活后形成具有多孔网状结构的固态聚合凝胶。其在创伤愈合过程中是一种天然的细胞生长支架，可提供细胞附着生长的场所。纤维蛋白凝胶还可作为软骨细胞载体构建不同形状的软骨组织［32］。天然的纤维蛋白凝胶容易被生物酶降解，且机械强度不足。Bioseed®C利用经过化学改造的纤维蛋白胶，添加丙交脂/乙交脂共聚物和二氧杂环己酮，增加纤维蛋白的机械强度，降低降解速率，提高稳定性［33］。

Kreuz等［34］近期报道了19例Bioseed®-C治疗膝关节创伤性软骨损伤患者(放射学检查确诊骨性关节炎)4年临床随访结果。结果在术后6个月，患者的ICRS和Lysholm评分显著提高。MRI检查显示有6例软骨损伤区域填充完全，显示正常或部分高信号。2例术后症状无改善患者4年后行全膝关节置换。研究提示该技术可作为治疗早期关节软骨退行性变的一种方法。

Niemeyer等［35］总结了309例用ACI(骨膜覆盖52例，14.9%;胶原蛋白膜覆盖215例，61.6%)或Bioseed®-C(82例，23.5%)治疗膝关节软骨损伤患者临床资料，对术后并发症及失败病例进行回顾。最主要的术后并发症包括植入物增生、新生软骨与周围正常软骨组织融合不良、软骨再生不足，以及植入物脱落等。据统计，植入物增生的总发生率为5.2%，但骨膜覆盖的ACI治疗患者发生率为15.4%。新生软骨与周围正常软骨组织融合不良主要发生在胶原蛋白膜覆盖的ACI(3.7%)和Bioseed®-C(4.8%)治疗的患者。另外，髌骨关节面软骨损伤的修复术后并发症较高，特别是植入物增生。另一项Bioseed®-C (42例)与第一代ACI技术(40例)的临床对照研究结果显示，两组患者术后5年临床症状均显著缓解。平均Lysholm评分Bioseed®-C治疗患者从47分提高到78分，ACI治疗患者从33分提高到70分，两组关节功能提高差异无统计学意义。因此认为Bioseed®-C治疗膝关节软骨损伤的中期临床效果与ACI相当，且术后不良反应较ACI少［36］。

2.4 CaReS®

CaRes®又称为软骨再生系统(cartilage regeneration system)，是利用患者自体软骨细胞与Ⅰ型胶原蛋白胶在体外共同培养，通过模具塑形形成的凝胶状产品。细胞培养用血清来源于患者，克服了使用动物血清可能导致疾病传播等弊端。培养周期约为2周，植入时用纤维胶固定。该技术目前已进入中国，在天津完成生产净化车间的建设，正在一些医院进行小样本的临床试验。

2006年，Andereya等［37］报道了CaRes®临床应用结果，14例股关节损伤患者平均修复缺损面积6 cm2，平均手术切口长度8.2 cm。经过2年随访，关节功能均有提高，84.6%的患者达到优良。2007年该作者又报道了该技术在修复髌股关节软骨缺损的应用，14例患者随访2年，优良率达78.6%［38］。

2.5 Cartipatch®

Cartipatch®利用具有温度敏感性的水凝胶作为自体软骨细胞的载体。水凝胶的主要成分为琼脂糖和藻酸盐，在25℃左右呈液态，可与细胞悬液混合，当温度上升到37℃时形成凝胶状。手术操作时，通过微创切口在器械的协助下将1至数个细胞－水凝胶载体以镶嵌模式覆盖到软骨缺损表面。

Cartipatch®在法国进行了一项前瞻性多中心临床研究，入组17例患者，随访2年。证实该技术可用于治疗缺损面积超过3 cm2的全层关节软骨缺损，62%(8/13)的患者可见透明样软骨生成［39］。

其他已经在全球各个地区进入临床应用的组织工程化软骨产品还包括Novocart®3D［40］和BioCartⅡ［29］等。各种不同组织工程生物支架联合软骨细胞移植技术在多个国家和地区进入临床应用，近期效果虽然乐观，但是大部分的文献报道样本数量较少，随访年限短，远期疗效尚不明确。同时，多中心随机对照研究的报道结果偏少，仅有少数传统修复技术与不同组织工程化软骨技术随机对照的循证医学证据。

在技术上，软骨细胞移植技术均采用一期关节镜下获取患者新鲜软骨，在体外分离增殖培养的自体软骨细胞后，二期手术植入细胞－载体复合物行缺损修复。细胞的培养周期一般需要2周，耗时较长，操作繁琐，实际操作需要外科医生、细胞生物学家与器械设备的紧密配合。生物支架通常也比较昂贵，临床推广存在一定的难度。组织修复以纤维软骨或透明样软骨与纤维软骨混合为主，无法完全恢复关节透明软骨典型的层状分布组织结构。

3 干细胞移植技术

组织工程化软骨技术有两个核心问题，一个是生物支架材料的选择，另一个是种子细胞来源。除了自体或异体的软骨细胞外，研究者对间充质干细胞修复软骨的潜能也进行了大量的研究［41-43］。间充质干细胞是一种具有多分化潜能的原始细胞。间充质干细胞来源较软骨细胞丰富，在脐血或成人骨髓中大量存在，在一些成体组织例如骨膜、肌肉、脂肪组织、软骨组织和滑膜组织中也有［44-48］。因此，间充质干细胞，特别是骨髓来源的间充质干细胞也可作为关节软骨缺损组织工程修复的种子细胞。

成人骨髓中除了间充质干细胞外，还有许多其他的细胞成分。一般来说，人们倾向于分离出单纯的间充质干细胞，在体外经过扩增后配合生物载体植入体内［49-50］。Wakitani等［51］报道利用体外扩增的骨髓间充质干细胞结合胶原蛋白胶载体修复内侧股骨髁软骨损伤的临床对照试验。总共24例膝关节炎行高位胫骨截骨术患者，实验组(12例)从髂前上棘行骨穿取骨髓后离心分离出有核细胞，在二维平面培养增殖，细胞达到一定数量后与可溶性Ⅰ型胶原蛋白混合后固化成胶状，之后通过开放手术植入到损伤部位;对照组使用空白胶原蛋白胶对照。结果显示两组患者在功能改善方面无明显差异，但是实验组的关节镜检查和组织学检查结果明显优于对照组。

另外还有学者提出，组织修复除了需要特定的细胞类型和载体之外，还要求特定的生物微环境，包括细胞间通讯、生长因子、细胞因子和其他类型细胞的参与，调节间充质干细胞分化和神经血管生成。骨髓中的造血干细胞等其他类型细胞和体液因子正是扮演这样的角色，协助间充质干细胞完成组织修复过程［52-53］。在这样的理论基础上，有人提出了应用含有多种细胞成分的浓缩骨髓有核细胞作为关节软骨修复的细胞来源［54］。

Giannini等［55］首先将该技术应用于临床进行了一项前瞻性的研究，入组距骨骨软骨损伤患者48例，随访超过24个月。首先，从患者的髂骨上棘穿刺获得大约60 mL的全骨髓液，利用一个细胞分离浓缩器过滤掉骨髓中的大部分血清和红细胞，分离出包括间充质干细胞、造血干细胞、单核细胞及淋巴细胞在内的有核细胞。然后，细胞与胶原蛋白粉剂及富含血小板的纤维胶混合，形成胶冻状;或与透明质酸膜结合，填补关节骨软骨缺损。研究结果提示，该技术可用于修复踝关节骨软骨缺损，患者术后关节功能均有所提高，MRI检查可见缺损填充，活组织病理学检查显示纤维软骨及大量蛋白聚糖生成。该技术可避免体外细胞增殖培养等步骤，在一期手术中即可完成自体骨髓细胞的采集和植入，减少多次侵入性操作给患者造成的创伤，大大缩短了患者等候时间，也减少了治疗费用。

干细胞的应用可克服软骨组织缺乏、软骨细胞表型不稳定等问题。但在细胞分化调节和稳定性维持方面还需要进一步研究。结合细胞因子或生长因子定向诱导干细胞分化，可维持细胞的活性和正常功能。一方面可以通过转基因技术，在基因水平上对细胞进行修饰，使其向软骨细胞定向分化并保持长久的稳定功能［56］;另一方面通过改造细胞支架的组分，改变孔隙大小，控制细胞因子的释放速度等［57］。

经过近30年的探索，组织工程化软骨技术在临床的应用日趋成熟，成为国内外业者研究讨论的热点。在国际上，特别是欧美发达国家的临床医生与研究人员不断开拓创新，给我们提供了许多值得借鉴的知识与经验。技术的临床应用伴随着临床问题的不断发现，又给研究者提出新的要求、提供新的思路，从而促进新技术的不断涌现。组织工程化软骨技术在国内的发展还相对落后，部分研究人员局限于对国外现有技术的重复验证。加上国内医疗环境的限制，新技术临床试验等伦理规范的不完善，使得组织工程学研究成果在临床的应用难以发展。组织工程学的临床推广，需要临床从业者和基础研究人员的紧密合作，配备符合卫生安全规范的生物产品生产车间;需要专职部门从患者安全及技术创新等方面考虑制定有效可行的技术规范，对基础研究和临床应用进行指导与管理。

尽管当前组织工程化软骨技术在一定程度上解决了软骨损伤引起关节功能障碍等问题，但是仍未完全复原关节透明软骨特有的组织结构和成分分布。重建具备关节软骨特异性的层状结构仍然是一大难题。国际上，更为前沿的研究队伍除了关注关节的功能修复外，更多立足于细胞水平和分子水平探讨软骨组织的修复机制，希望通过改善种子细胞来源，提高生物载体的生物力学特性及生物相容性，精细调控细胞的增殖、分化和成熟等手段优化组织工程化软骨技术。随着人们对关节软骨生物特性及修复机制越来越多的认识，我们相信在可以预见的未来，一定能够开发出理想的组织工程修复技术及其产品，为关节软骨损伤患者造福。

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Cellular imp lantation and cartilage tissue engineering in articular cartilage defect repairing:the current status of clinicalapplication

LIN Zhen*，ZHENGQiu-jian，ZHENGMing-hao.*Division of Orthopedic，Department of Surgery，Guangdong General Hospital，Guangdong Academic of Medical Sciences，Guangzhou 510080，China

ZHENGMing-hao，Email:minghao.zheng@uwa.edu.au

Cell based cartilage tissue engineering therapy is an advancing approach for the treatment of articular cartilage defect and one of the recent focuses in the field of orthopedic research.These techniques include chondrocyte implantation，cell-scaffold construct implantation，and stem cell therapy.The review introduced a number of tissue engineered cartilage techniques that have been conducted in the clinic worldwide，and summarized the outcomes of the clinical studies.

Cellular therapy; Cartilage repair; Tissue engineering; Chondrocyte

2010-01-14)

(本文编辑:沈敏 蒋婉洁)

10.3877/cma.j.issn.1674-3903.2010.02.011

广东省医学科研基金资助项目(B2009004)

510080广州，广东省医学科学院 广东省人民医院骨外科(林桢、郑秋坚);浙江大学医学院干细胞与组织工程实验室(郑铭豪)

郑铭豪，Email:minghao.zheng@uwa.edu.au

本文文献引用格式:林桢，郑秋坚，郑铭豪.细胞移植及软骨组织工程技术在关节软骨损伤临床应用进展［J/CD］.中华移植杂志:电子版，2010，4(2):136-142.