复方槐米抗氧化剂的复配及抗氧化特性研究

张凤清，侯 君，李自义

(1.长春工业大学化学与生命科学学院，吉林 长春 130012；2.抚松县大自然生物工程有限公司，吉林 抚松 134500)

复方槐米抗氧化剂的复配及抗氧化特性研究

张凤清1，侯 君1，李自义2

(1.长春工业大学化学与生命科学学院，吉林 长春 130012；2.抚松县大自然生物工程有限公司，吉林 抚松 134500)

以大豆油为氧化底物，确定槐米提取物和甘草提取物的最佳复合配比。利用薄层层析和红外光谱分析对复方槐米抗氧化剂(FHK)定性检识，用HPLC法进行定量检测。通过对邻苯三酚自氧化抑制率和DPPH自由基抑制率的测定及其对月饼过氧化值变化影响来考察复方槐米抗氧化剂的抗氧化活性。结果表明：槐米提取物和甘草提取物质量配比为1:1时抗氧化作用最强。FHK含有效成分芦丁和甘草苷，分子中含有酚羟基，并为缔合型，芦丁含量为76.8%，甘草苷含量为0.46%。FHK质量浓度为1.5g/L时，对邻苯三酚自氧化的抑制率高达67.64%；质量浓度为10mg/mL时，对DPPH自由基的抑制率高达62.88%。与空白样相比可以延长广式月饼保质期约一个月左右。

槐米；甘草；抗氧化剂；抗氧化

Abstract：Soybean oil was used to investigate the optimization of mixing ratio (m/m) for the water extract from Flos Sophorae Immaturus and the ethanol extract from Radix Glycyrrhizae for the protection of processed foods against lipid oxidation. Both the extracts were analyzed qualitatively by thin layer chromatography and IR spectroscopy and HPLC was employed for quantification. The antioxidant properties of a mixture of both the extracts having the best protective effect against lipid oxidation in soybean oil were evaluated by superoxide anion free radical scavenging assay and DPPH free radical scavenging assay and investigation of the protection of Cantonese-style moon cake against oxidation by the use of it was conducted. The optimum mixing ratio for both the extracts was 1:1. Rutin and glycyrrhizin were detected in the water extract from Flos Sophorae Immaturus and the ethanol extract from Radix Glycyrrhizae, respectively. IR spectroscopic analysis demonstrated that both the extracts contained molecules in which the phenolic hydroxyl group was associative type. The contents of rutin and glycyrrhizin in the mixture of both the extracts at 1:1 were determined by HPLC to be 76.8% and 0.46%, respectively. At a concentration of 1.5 g/L, the scavenging ratio of the mixture against superoxide anion free radicals was as high as 67.64%, and its DPPH free radical scavenging ratio at 10 mg/mL reached up to 62.88%. The shelf-life of Cantonese-style moon cake could be prolonged to around a month by the use of the mixture.

Key words：Flos Sophorae Immaturus；Radix Glycyrrhizae；antioxidant；antioxidation

槐米是豆科植物槐(Sophora japonica)的干燥花蕾，其主要功效成分是芦丁(又名芸香苷)，属于黄酮醇类化合物。甘草为豆科植物甘草(Glycyrrhiza uralensis Fisch)、光果甘草(G.glabral)、胀果甘草(G.inflata Batal)的干燥根及根茎。甘草的主要化学成分除甘草酸和甘草次酸外还含有甘草苷等100多种黄酮类化合物。槐米提取物中的芦丁和甘草提取物中的甘草苷因分子中酚羟基的存在而表现出较强的递氢能力[1]。槐米、甘草是我国传统中药，同时被我国卫生部列为药食兼用植物，是我国保健食品基料。甘草提取物在GB2760—2007《食品添加剂使用卫生标准》中有允许限量标准。有文献报道，槐米和甘草能有效抑制大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草杆菌，槐米、甘草提取物具有明显的抗氧化活性和抑菌活性[2-3]。但是有关科学配伍后综合考察其抗氧化活性方面还未见报道。复方槐米抗氧化剂在以月饼为代表的粮油食品中应用而延长其保质期的研究也未有报道。

本研究以大豆油为氧化底物，研究槐米提取物和甘草提取物的最佳复合配比。并对其成分和抗氧化特性进行研究，以期为槐米复配物应用于工业生产提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂与仪器

槐米产自山东，甘草产自内蒙古，购自北京同仁堂长春市分店，由长春市药品检验所鉴定为合格原料药；大豆油(不含抗氧化剂) 吉林省德大食品有限公司；广式月饼 本实验室自制。

护B抗氧化剂 上海健鹰食品添加剂有限公司；芦丁(批号 0080-9705)、甘草苷(批号 190880-200608) 中国药品生物制品检定所；AB-8大孔树脂 南开大学化工厂；1,1-二苯基-2-苦基肼 (DPPH) 美国Sigma公司；邻苯三酚 天津市光复精细化工研究所；硅胶G 温州市化学用料厂；甲醇(色谱纯)；无水乙醇、三氯甲烷、冰乙酸等均为国产分析纯；HPLC法检测用水为娃哈哈纯净水。

101-1AB型电热鼓风干燥箱 天津市泰斯特仪器有限公司；FW-400A倾斜式高速万能粉碎机 北京中兴伟业仪器有限公司；QPG-1型喷雾干燥机 辽宁省石化电控设备厂；AL-104电子分析天平 北京赛普分利斯天平有限公司；SHB-ⅢA型循环水式多用真空泵 上海豫康科教仪器设备有限公司；1100型高效液相色谱仪 美国Agilent公司；FI-IR型远红外光谱仪 Perkin Elmer公司；HH-601数显恒温水浴箱 江苏金坛市恒丰仪器厂。

1.2 方法

1.2.1 槐米粗提物、甘草粗提物制备[4-5]

槐米粗提物提取工艺：槐米→粉碎(40目)→冷水浸泡(1h，料液比1:15(m/V))→沸水浴中水煎(40min)→趁热抽滤(滤渣水煎两次)→合并滤液→静置(常温，12h)→抽滤→滤上物热水重结晶一次→恒温干燥(60℃)

甘草粗提物提取工艺：甘草→粉碎(40目)→75%乙醇回流提取(料液比1:10(m/V)，65℃，1h)→抽滤→减压浓缩→喷雾干燥(进料速度40mL/min，进风温度115℃，出风温度85℃)

1.2.2 槐米粗提物、甘草粗提物复配比例确定

将槐米粗提物、甘草粗提物按表1搭配方案对豆油的抗氧化效果进行比较，以过氧化值(POV)为指标优选最佳配比，以VC作为增效剂，槐米和甘草混合物添加质量为油脂质量的0.2%，VC添加质量为油脂质量的0.02%[6]。护B添加质量为油脂质量的0.1%。按表1方案进行实验分组。

表1 槐米、甘草质量配比方案Table 1 Mixing ratios for the water extract from Flos Sophorae Immaturus and the ethanol extract from Radix Glycyrrhizae designed in this study

采用烘箱加速氧化法：取50g豆油，置于锥形瓶中，加入各实验方案的物质，搅拌均匀，置于空气对流良好的60℃恒温箱内保存，每隔24h搅拌一次，并交换其在恒温箱中位置，按照GB/T 5009.37—2003《食用植物油卫生标准的分析方法》定期测定油样过氧化值(meq/kg)，比较抗氧化指数[7]。

式中：t样品为添加抗氧化剂油样POV达到100meq/kg所需时间；t空白这空白油样POV达到100meq/kg所需时间；Pf为抗氧化指数。

1.2.3 复方槐米抗氧化剂(FHK)分析检测方法

1.2.3.1 薄层色谱定性检识[8]

样品处理：取FHK(按1.2.2节确定的最佳比例配置)0.1g用10mL 75%乙醇溶解并过滤。滤液作为供试品溶液。

芦丁鉴定方法：取供试品和芦丁对照品溶液(1mg/mL甲醇溶液)。分别点于同一块硅胶G(10cm×20cm)薄层板上，以乙酸乙酯:甲酸:水=8:1:1为展开剂，展开，取出，晾干，喷以三氯化铝试液，待乙醇挥干后，置日光和紫外光灯(波长365nm)下检视。

甘草苷薄层鉴定方法：取供试品和甘草苷对照品溶液(1mg/mL甲醇溶液)点于同一块硅胶G薄层板上，以乙酸乙酯:甲酸:冰醋酸:水=15:1:1:2为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10%硫酸乙醇溶液，在105℃加热至斑点显色清晰，置日光和紫外光灯(波长365nm)下检视。

1.2.3.2 红外光谱分析

分别取少量芦丁和甘草苷标准品，与KBr混合，压制成片；再分别取少量槐米粗提物和甘草粗提物，与KBr混合，压制成片。置于红外光谱仪下进行红外色谱扫描。

1.2.3.3 HPLC法含量测定[9-10]

色谱工作条件与系统适用性实验：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以乙腈-0.5%冰醋酸(1:4，V/V)为流动相，检测波长276nm，理论塔板数按甘草苷峰计算应不低于4000。进样量20μL。

对照品甘草苷溶液质量浓度25.4μg/mL甲醇溶液。对照品芦丁溶液浓度25.4μg/mL甲醇溶液样品溶液。

FHK纯化处理：1.0gFHK 经D101大孔吸附树脂柱(2cm×40cm)分离，先用水洗脱，再用20%～80%乙醇梯度洗脱，收集各浓度乙醇解析液。精密量取5mL置100mL容量瓶中，用20%乙腈稀释至刻度。对峰面积和质量浓度进行线性回归，绘制工作曲线。根据样品线性范围内峰面积计算含量。样品重复进样两次，取平均值。

1.2.4 FHK抗氧化实验设计

1.2.4.1 清除DPPH自由基[11]

配制不同质量浓度甘草和槐米复合抗氧化剂的70%乙醇样品液： 40、30、20、10、9、8、7、6、5、4、3、2、1mg/mL，精确吸取样品溶液2.0mL，加入2.0mL 2×10-4mol/L DPPH无水乙醇溶液配制，摇匀，放置30min，以70%乙醇为空白，分别测定518nm波长处吸光度(Ai)。同时，测定样品溶液2.0mL与70%乙醇2.0mL混合液518nm波长处吸光度(Aj)；再测定DPPH溶液2.0mL与乙醇2.0mL混合液518nm波长处吸光度(Ac)；进一步实验采用最大抑制率时质量浓度。

1.2.4.2 抑制邻苯三酚自氧化实验[12]

将9mL Tris-HCl缓冲溶液(pH8.2)加入到试管中并加入0.2mL蒸馏水，25℃预热20min，加热预热至25℃的50mmol/L邻苯三酚溶液50μL，摇匀，3min后加入一滴0.11mol/L VC溶液，静置5min后在420nm波长处测其吸光度(A0)。将9mL Tris-HCl缓冲液加入到试管中，然后加入0.2mL各样品，样品质量浓度为0、0.1、0.5、 1.0、1.5、2.0g/L， 25℃预热20min，后加入预热至25℃的50mmol/L邻苯三酚溶液50μL，3min后滴入一滴0.11mol/L VC，静置5min后在波长420nm处测其吸光度(As)。

1.2.4.3 FHK在广式月饼中的抗氧化应用[13]

广式月饼配方：皮料(低筋粉)2.0kg、绵白糖0.6kg、大豆色拉油 0.5kg、NH4CO30.4g、水 0.5kg，馅料(红豆沙) 8.0kg。FHK添加质量为皮料油脂质量的0.1%。设置空白组和对照样(护B)。

过氧化值测定：按GB/T 5009.37—2003《食用植物油卫生标准的分析方法》方法进行。每隔一周测定一次，动态观察POV变化情况。月饼塑料袋封口保藏[14]。

皮料油脂提取方法：取皮料适量，研钵粉碎，用石油醚浸泡过夜，过滤并挥发石油醚。

2 结果与分析

2.1 槐米粗提物、甘草粗提物最佳配比

表2 抗氧化效果筛选表Table 2 Protective effects of mixtures generated from the mixing protocol as shown in Table 1 against lipid oxidation in soybean oil

Pf值越高，说明抗油脂氧化效果越好，虽然天然抗氧化剂作用机制不同，但它们具有较好的协同作用。由表2可见FHK成分样品B与样品G抗氧化效果相当。槐米粗提物、甘草粗提物最佳质量配比为1:1。

2.2 薄层层析鉴别FHK成分

图1 甘草苷薄层层析Fig.1 Thin layer chromatographic pattern showing the existence of glycyrrhizin

图2 芦丁薄层层析Fig.2 Thin layer chromatographic pattern showing the existence of runtin

日光下色谱图见图1、2。图谱说明FHK中存在活性成分芦丁和甘草苷。

2.3 红外光谱分析槐米粗提物和甘草粗提物

由图3～6可知，槐米、甘草提取物红外光谱图中3420、3400cm-1处各有一宽峰出现，说明分子内酚羟基为缔合型，这与槐米、甘草中黄酮类化合物A环和C环上带有多位酚羟基结构相吻合。

图4 槐米提取物红外图谱Fig.4 IR spectrum of the water extract from Flos Sophorae Immaturus

图6 甘草提取物红外光谱Fig.6 IR spectrum of the ethanol extract from Radix Glycyrrhizae

2.4 FHK中芦丁含量和甘草苷含量检测

工作曲线见图7、8。样品高效液相色谱见图9。

图7 芦丁标准曲线Fig.7 Standard curve of rutin

图8 甘草苷标准曲线Fig.8 Standard curve of glycyrrhizin

图9 浓缩2.5倍FHK液相色谱Fig.9 HPLC chromatogram of a 2.5-fold concentrate of the mixture of the water extract from Flos Sophorae Immaturus and the ethanol extract from Radix Glycyrrhizae at 1:1 mass ratio

图10 稀释6倍FHK液相色谱Fig.10 HPLC chromatogram of a 6-fold dilution of the mixture of the water extract from Flos Sophorae Immaturus and the ethanol extract from Radix Glycyrrhizae at 1:1 mass ratio

由图9得出甘草苷峰面积为459.95mAU·s，由图10得出芦丁峰面积为244.30mAU·s，计算得出芦丁含量为76.8%，甘草苷含量为0.46%。

2.5 FHK对DPPH自由基的抑制率[15]

图11 不同质量浓度FHK对DPPH自由基抑制率曲线Fig.11 Concentration-dependent DPPH radical scavenging curve of the mixture of the water extract from Flos Sophorae Immaturus and the ethanol extract from Radix Glycyrrhizae at 1:1 mass ratio

由图11可见，FHK质量浓度不同，对DPPH自由基抑制程度不同，当样品质量浓度为10mg/mL，对DPPH试剂的抑制率最高，达62.88%。

2.6 FHK对邻苯三酚自氧化的抑制率

图12 不同质量浓度FHK对邻苯三酚抑制率曲线Fig.12 Concentration-dependent superoxide anion radical scavenging curve of the mixture of the water extract from Flos Sophorae Immaturus and the ethanol extract from Radix Glycyrrhizae at 1:1 mass ratio

由图12可见，FHK质量浓度为1.5mg/mL时，对邻苯三酚自氧化的抑制率最高为67.64%。

邻苯三酚在酸性环境中稳定，但在弱碱性环境中会发生自氧化，邻苯三酚在自氧化时只接受一个电子，生成超氧阴离子自由基，并在自氧化过程中以一定速率产生有色中间产物，芦丁和甘草苷可以提供质子，将清除超氧阴离子自由基，从而抑制邻苯三酚自氧化的速率。

2.7 FHK对月饼保质期影响

图13 FHK与空白组、护B对月饼POV值影响Fig.13 Prolonging effect of the mixture of the water extract from Flos Sophorae Immaturus and the ethanol extract from Radix Glycyrrhizae at 1:1 mass ratio on the shelf-life of Cantonese-style moon cake

以POV值为考察指标， FHK与对照样护B相比月饼POV值随时间变化见图13。可见，与空白样相比，加FHK的月饼比空白样月饼延长一个月左右，比加入护B月饼延长10d左右。

3 结 论

通过薄层层析和红外光谱鉴别出FHK中含有芦丁和甘草苷，官能团酚羟基属于分子内缔合型。芦丁和甘草苷可以提供多个氢原子，使自由基形成稳定结构，代替了作为供氢体的油脂分子，结束油脂分子氧化的链式反应，而自身生成的醌式自由基，可通过分子内部的电子共振而抑制，起到抗氧化的作用。

用水提法得到槐米粗提物，用乙醇回流提取法得到甘草粗提物，以豆油为氧化底物，利用烘箱加速氧化法，确定FHK的配方为槐米粗提物和甘草粗提物质量比为1:1。

通过对DPPH自由基的活性清除、对邻苯三酚自氧化抑制及对富油食品月饼储藏期过氧化值的影响等实验结果分析，得出FHK有较强的抗氧化活性。其中对DPPH自由基抑制率达62.88%，对苯三酚自氧化抑制率达67.64%。可以有效地延长月饼保质期(以POV值为指标)。

建立HPLC法同时鉴定有效成分芦丁和甘草苷，色谱条件适宜，芦丁和甘草苷在同一谱图中得到有效分离，芦丁含量为76.8%，甘草苷含量为0.46%。

复方槐米抗氧化剂是集天然、安全、抗氧化、抑菌、保健于一体的功能型食品添加剂，作为新型功能性食品添加剂使用，符合人们追求绿色、安全、保健的消费时尚。

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Optimum Mixing Ratio for Water Extract from Flos Sophorae Immaturus and Ethanol Extract from Radix Glycyrrhizae for Protection of Processed Foods against Lipid Oxidation and Antioxidant Properties of the Mixture

ZHANG Feng-qing1，HOU Jun1，LI Zi-yi2
(1. School of Chemistry and Life Science, Changchun University of Technology, Changchun 130012, China；2. Fusong County Natural Biotechnology Co.Ltd., Fusong 134500, China)

TS202.3

A

1002-6630(2010)15-0130-05

2010-04-15

吉林省科技发展计划项目(20065027)

张凤清(1967—)，女，副教授，硕士，研究方向为天然产物抗氧化保鲜特性。E-mail：zfq671025@163.com