舒筋通络外用颗粒质量标准的研究

2010-09-13夏曦，刘玲

中国医药导报 2010年28期

夏曦，刘玲

（广东省佛山市顺德龙江医院，广东顺德 528318）

舒筋通络外用颗粒为顺德龙江医院制剂，由当归、大黄、独活、桂枝等十三味中药组成。采用部分药材粉碎成细粉，其余药材水煮醇沉制成稠浸膏后与细粉混合干燥而成的一种外用颗粒剂。使用时加水外洗、外敷均可，具有温经通络，祛瘀止痛的作用，用于跌打损伤，筋骨疼痛，关节不利。本文建立了当归、大黄、独活、桂枝的薄层色谱鉴别，并采用高效液相色谱法对其主要成分大黄素（C15H10O5）和大黄酚（C15H10O4）进行含量测定，现报道如下：

1 仪器与试药

1.1 仪器

Agilent 1100高效液相色谱仪、Agilent化学工作站（美国安捷伦科技有限公司）；METTLER AE240电子分析天平；CQ-20超声波清洗器。

1.2 试药

大黄素、大黄酚对照品及当归、独活、桂枝、大黄对照药材，均由中国药品生物制品检定所提供；舒筋通络外用颗粒，由广东省顺德龙江医院制剂室提供；甲醇光谱纯（天津四友化工厂）；薄层层析硅胶G（化学纯，中国青岛海洋化工集团公司）；其他试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 薄层色谱鉴别

2.1.1 当归、桂枝、独活薄层鉴别

因大黄的5个蒽醌类成分对当归、桂枝、独活的薄层色谱鉴别有干扰，故先用0.1 mol/L氢氧化钠溶液将其分离出去；曾用石油醚（60～90℃）-醋酸乙酯（4∶1）为展开剂进行薄层层析，但当归的色谱斑点与桂枝的色谱斑点分离度欠佳，当选用大黄的薄层色谱展开剂系统时，当归、桂枝、独活的色谱成分均能达到有效分离。

2.1.1.1 供试品溶液的制备取本品3 g，研细，加乙醚40 ml，超声处理10 min，滤过，滤液置分液漏斗中，用0.1 mol/L氢氧化钠溶液洗涤3次，每次20 ml，合并洗液，备用。乙醚液再用水10 ml，洗涤1次，挥干乙醚，残渣加无水乙醇1 ml使溶解，作为供试品溶液。

2.1.1.2 对照药材溶液的制备取当归对照药材0.8 g，桂枝对照药材0.2 g，独活对照药材0.5 g，分别加乙醚30 ml，超声处理10 min，滤过，滤液挥干，残渣加无水乙醇1 ml使溶解，作为对照药材溶液。

2.1.1.3 阴性对照溶液的制备按处方比例及制法，分别制成缺当归、桂枝、独活的阴性样品，各取3 g，按供试品溶液的制备方法制成阴性对照溶液。

2.1.1.4 薄层层析照薄层色谱法（《中国药典》2005年版一部附录ⅥB）试验，吸取上述七种溶液各2 μl，分别点于同一以羧甲基纤维素钠为黏合剂的硅胶G薄层板上，以石油醚（30～60℃）－甲酸乙酯－甲酸（15∶5∶1）的上层溶液为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯（365 nm）下检识。供试品色谱中，在与当归对照药材色谱相应的位置上，显相同的亮蓝白色荧光斑点；在与桂枝对照药材色谱相应的位置上，显相同的绿色荧光斑点；在与独活对照药材色谱相应的位置上，显相同的蓝紫色荧光斑点。阴性对照色谱在相应位置上无干扰，可作为当归、桂枝、独活的薄层色谱鉴别，结果见图1。

2.1.2 大黄薄层鉴别

大黄中含有多种蒽醌类成分，具有抗菌、抗感染等作用。考虑大黄素和大黄酚在其他药材中存在，故在含量测定项测定大黄素和大黄酚之前，还要进行大黄的薄层色谱鉴别，用大黄对照药材作为对照，与其他含有大黄素和大黄酚的药材进行区别。

2.1.2.1 供试品溶液的制备取“2.1.1.1”项下的洗液用1 mol/L盐酸溶液调节pH值至1～2，用乙醚提取3次，每次20 ml，合并提取液，挥干，残渣加无水乙醇5 ml使溶解，作为供试品溶液。

2.1.2.2 大黄对照药材溶液的制备取大黄对照药材0.1 g，加乙醚30 ml，超声处理10 min，滤过，滤液挥干，残渣加无水乙醇1 ml使溶解，作为对照药材溶液。

2.1.2.3 大黄阴性对照溶液的制备按处方比例及制法，制成不含大黄的阴性样品，取3 g，按“2.1.2.1”项下方法制成大黄阴性对照溶液。

2.1.2.4 薄层层析照薄层色谱法（《中国药典》2005年版一部附录ⅥB）试验，吸取上述三种溶液各5 μl，分别点于同一以羧甲基纤维素钠为黏合剂的硅胶G薄层板上，以石油醚（30～60℃）－甲酸乙酯－甲酸（15∶5∶1）的上层溶液为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯（365 nm）下检识。供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同的5个橙黄色荧光主斑点。阴性对照色谱在相应位置上无干扰，可作为大黄的薄层色谱鉴别，结果见图2。

因当归、桂枝、独活的色谱成分对大黄的薄层色谱鉴别有干扰，故先将大黄的蒽醌类成分用0.1 mol/L的氢氧化钠溶液分离出来，酸化后再用乙醚进行提取。

2.2 含量测定

本品处方由13味中药组成，其中以大黄为主药，大黄素和大黄酚是其主要有效成分，故选作含量测定指标。正文参照《中国药典》2005年版及2000年版一部“大黄”项下收载的含量测定方法，采用HPLC法测定两者的总量，试验结果如下：

2.2.1 色谱条件

色谱柱：大连依利特Hypersil ODS-2（4.6 mm×200 mm，5 μm）；流动相：甲醇-0.1%磷酸溶液（85∶15）；检测波长：254 nm；流速：1.0 ml/min。柱温：30℃。

2.2.2 对照品溶液的制备

精密称取大黄素和大黄酚对照品适量，加甲醇制成每毫升含大黄素10 μg、大黄酚25 μg的混合溶液，即得。

2.2.3 供试品溶液的制备

取本品，研细，取约1 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇25 ml，称定重量，加热回流1 h，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过。精密量取续滤液5 ml，置烧瓶中，挥去溶剂，加8%盐酸溶液10 ml，超声处理2 min，再加三氯甲烷10 ml，加热回流1 h，放冷，置分液漏斗中，用少量三氯甲烷洗涤容器，并置入分液漏斗中，分取三氯甲烷层，酸液再用三氯甲烷提取3次，每次10 ml，合并三氯甲烷液，减压回收溶剂至干，残渣加甲醇溶解，转移至10 ml量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.2.4 阴性溶液的制备

取按处方比例及制法制备的缺大黄阴性样品，按“2.2.3”项下方法制备样品溶液，即得。

2.2.5 测定波长的选择

分别取大黄素和大黄酚对照品溶液，在200～500 nm波长范围内扫描，结果大黄素在 221、254、265、290、437 nm，大黄酚在 204、225、256、278、287、429 nm 波长处有最大吸收，两者均在（254±2）nm波长处有最大吸收，为了同时测定大黄素和大黄酚的含量，故选择测定波长为254 nm，与《中国药典》2000年版及2005年版一部“大黄”含量测定项下测定波长相同。

2.2.6 系统适用性

分别取对照品溶液、供试品溶液以及阴性对照品溶液，按上述色谱条件进行试验，考察系统适用性。HPLC色谱图见图3。结果表明阴性对照品溶液对测定没有干扰。

2.2.7 线性关系考察

2.2.7.1 大黄素分别精密吸取每毫升含大黄素1.00、2.00、5.00、10.00、20.00、50.00 μg 的大黄素对照品溶液 10 μl，注入高效液相色谱仪，按上述色谱条件测定色谱峰面积，测得峰面积分别为 37.25、73.35、185.51、372.17、744.59、1 868.63。以对照品进样量（μg）为横坐标，峰面积为纵坐标，计算回归方程，结果表明，大黄素在0.010 0～0.500 0 μg范围内，呈良好的线性关系。回归方程为Y=3 738.66X-1.420 8（r=0.999 9）。

2.2.7.2 大黄酚分别精密吸取每毫升含大黄酚2.50、5.00、12.50、25.00、50.00、125.00 μg 的大黄酚对照品溶液 10 μl，注入高效液相色谱仪，按上述色谱条件测定色谱峰面积，测得峰面积分别为 129.37、259.09、649.07、1 325.46、2 636.84、6 388.43。以对照品进样量（μg）为横坐标，峰面积为纵坐标，计算回归方程，结果表明，大黄素在0.025 0～1.250 0 μg范围内，呈良好的线性关系。回归方程为Y=511 1.80X-23.717 7（r=0.999 9）。

2.2.8 精密度试验

精密吸取大黄素（10.00 μg/ml）、大黄酚（25.00 μg/ml）混合对照品溶液10 μl，重复进样6次，按上述色谱条件测定色谱峰面积，结果表明本法精密度良好。见表1。

表1 精密度试验（n=6）Tab.1 Precision test(n=6)

2.2.9 重复性试验

取同一批样品（批号：050701），按“2.2.3”项下方法制备6份供试品溶液，分别测定色谱峰面积，结果表明本法重复性良好。见表2。

表2 重复性试验（n=6）Tab.2 Repeatability test(n=6)

2.2.10 稳定性试验

取“2.2.3”项下供试品溶液，分别于放置 0、1、2、3、4、24 h后，注入液相色谱仪，测定色谱峰面积，结果表明供试品溶液在24 h内基本稳定。见表3。

表3 稳定性试验（n=6）Tab.3 Stability test(n=6)

2.2.11 加样回收试验

取同一供试品（批号：050701，测得大黄素含量为0.6654mg/g、大黄酚为1.640 3 mg/g）6份，各0.5 g，精密称定，分别精密加入对照品溶液（含大黄素 50.00 μg/ml、大黄酚 125.00 μg/ml）各5 ml，混匀，水浴挥干，按含量测定方法进行测定并计算回收率。结果见表4、5。

2.2.12 样品含量测定

取3批样品，按“2.2.3”项下方法制备样品溶液，用0.45 μm的微孔滤膜过滤，取续滤液，按上述色谱条件测定色谱峰面积，用外标法计算样品中大黄素和大黄酚的含量，结果见表6。