夏枯草多糖的清除自由基及抗氧化活性

熊双丽，李安林

（西南科技大学生命科学与工程学院，四川 绵阳 621010）

夏枯草多糖的清除自由基及抗氧化活性

熊双丽，李安林

（西南科技大学生命科学与工程学院，四川 绵阳 621010）

以夏枯草多糖提取率为考察指标，用正交设计试验确定夏枯草多糖的最佳提取工艺，并测定多糖的自由基清除活性和脂质过氧化抑制活性。结果发现：影响多糖提取率最主要的因素是料液比，其次是提取温度和时间。最优工艺条件为提取温度90℃，时间4 h，料液比1∶35（g/mL），多糖提取率达5.39%。夏枯草多糖对羟自由基和DPPH自由基的清除作用，以及卵磷脂脂质过氧化损伤抑制作用较强，在浓度为0.8 mg/mL时，羟基自由基清除率达96.25%，浓度为0.5 mg/mL，DPPH自由基清除率达68.81%。前两者的清除能力随着夏枯草多糖浓度升高而增强，并呈明显的量效关系，但当浓度超过一定值时，结果却相反。而多糖对卵磷脂脂质过氧化损伤的抑制作用一直呈正相关。

夏枯草；多糖；自由基

Abstract:This article mainly adopted orthogonal design experiment to optimize extracting technology of polysaccharide from Prunella Vulgaris Linn by using extraction rate as objective index,also determined the property of free radcial such as hydroxyl free radical and DPPH free radical and lipid peroxidation-inhibiting effect.The results exhibited that solid-liquid ratio is most important factor for the extraction percentage of the polysaccharides,the time and temperature are the second.The optimal extraction technology conditions are：temperature 90 ℃,extraction time 4 h,solid-liquid ratio 1∶35.The yield of the polysaccharides is 5.39%.The polysaccharide has good capability to scavenge the hydroxyl free radical and DPPH free radical,and the scavenging capability is obviously related to the concentrations.However,the results are contrary when concentration is excessive.The hydroxyl free radical-scavenging rate is 96.25%at the concentration of 0.8 mg/mL,while the DPPH free radical-scavenging rate is 68.81%at the concentration of 0.5 mg/mL.Polysaccharide also inhibits lipid peroxidation of lecithinum,which is also dependent on its concentration.

Key words：Prunella vulgaris Linn；polysaccharide；free radical

自由基医学研究表明，当机体的氧化与抗氧化处于一种动态平衡时，自由基是机体内不可缺少的活性物质，作为第二信使参与细胞信号转导[1]。而在患病或衰老等状态下，自由基水平明显升高，从而导致或加重许多疾病的发生，如动脉粥样硬化、肝病、糖尿病、癌症、老年痴呆症[2-3]。目前由于一些合成抗氧化剂，如二丁基羟基甲苯、丁基羟基茴香醚被发现有不同程度的致癌等毒副作用，因而在美国和日本已停止使用。目前，天然植物抗氧化剂日益成为研究的热点，广泛应用于食品、医药保健品和化妆品等行业[4-5]。夏枯草（Prunella vulga ris Linn）为唇形科植物,全球约15种，在我国主产于湖南、安徽、浙江、江苏。其主要成分含有三萜及其苷类、甾醇及其苷类、黄酮类、挥发油及糖类等[6]。目前报道得较多的是夏枯草小分子化合物的分离和生物活性，以及多糖的抗肿瘤、抗病毒等药理作用[7]。而对该多糖的工艺和自由基清除，以及抗氧化活性鲜见报道。本文主要优化夏枯草多糖的提取工艺，测定该多糖的羟基自由基清除活性、DPPH自由基清除活性和脂质过氧化抑制活性，为夏枯草新型功能食品的开发和进一步的综合利用提供理论参考。

1 材料与仪器

原料：夏枯草：成都药店。

主要试剂：DPPH自由基（二苯代苦味肼基自由基；2,2-diphenyl-1-picry-hydrazyl radical）；卵磷脂：Sigma公司，硫代巴比妥酸、水杨酸、三氯乙酸等皆为分析纯。

主要仪器：TU-1900双光束紫外可见分光光度计：北京普析有限责任公司；旋转蒸发器RE-52：上海亚荣生化仪器厂；SHB-IIS循环水式多用真空泵：郑州长城科工贸有限公司；MODULYOD冷冻真空干燥机：美国Thermo Electron公司；DZF-6020真空干燥箱：上海一恒仪器厂。

2 方法

2.1 夏枯草多糖提取工艺优化

2.1.1 夏枯草的预处理

称取一定量夏枯草粉末，用乙醇回流处理4 h，回流2次，以去掉部分醇溶性杂质如黄酮、色素、低聚糖等物质。再将回流后的残渣晾干后进行多糖提取。

2.1.2 正交试验设计

以往研究发现提取温度、时间、料液比对夏枯草多糖提取率影响较大。本文主要以提取液中多糖提取率为指标，采用三因素三水平以优化多糖的最佳提取工艺，正交设计方案如表1。

表1 因素水平设计表Table 1 The factors and levels of orthogonal design experiment

2.1.3 夏枯草多糖含量测定

总糖测定：采用硫酸-苯酚法（以葡萄糖为标准品）[8]。

还原糖测定：3,5-二硝基水杨酸测测定法[8]。

2.1.4 夏枯草多糖提取工艺

夏枯草全草粉→60℃烘干→粉碎过筛（40目）→乙醇去醇溶性物质2次→90℃搅拌提取4 h→50℃真空减压浓缩→大孔非极性吸附树脂HZ-820脱色→乙醇沉淀→50℃真空烘干→粗多糖M，以测定其自由基清除活性和抗氧化活性。

2.2 夏枯草多糖羟基自由基清除活性[9]

羟基自由基体系中加入水杨酸，生成有色物质2,3-二羟基苯甲酸，在此体系中加入具有清除羟基自由基（·OH）的被测物，从而使有色产物生成量减少，采用固定反应时间法，在相同体积的反应体系中8.8 mmol/L H2O2、6 mmol/L Fe2+和 6 mmol/L 水杨酸乙醇溶液）中加入一系列不同质量分数的夏枯草多糖溶液，并用去离子水作为参比，与试剂空白液比较，在510 nm处测量各质量分数下的吸光值，按下式计算夏枯草多糖的羟基自由基清除率：

式中：R为被测液对·OH的清除率；Ai为加试样和水杨酸溶液体系反应后溶液吸光度；Aj为不加水杨酸体系，只加试样的溶液的吸光度；Ac为不加试样，只加水杨酸体系的吸光值。

2.3 夏枯草多糖DPPH自由基清除活性[10]

DPPH自由基是一种稳定的以氮为中心的质子自由基，其乙醇溶液呈紫色，并在517 nm处有强烈吸收，在有自由基清除剂存在时，自由基清除剂提供一个电子与DPPH的孤对电子配对，而使其褪色，褪色程度与其接受的电子呈定量关系，在517 nm处的吸光度变小，其变化程度与自由基清除程度呈线形关系，即自由基清除剂的清除自由基能力越强，吸光度越小。按下式计算夏枯草多糖对DPPH自由基的清除率：

式中：K为被测液对DPPH自由基的清除率；Ai为加试样反应后DPPH溶液吸光度；Aj为不加DPPH，只加试样的溶液的吸光度；Ac为不加试样，只加DPPH的溶液的吸光度。

2.4 抑制脂质体过氧化能力[11-12]

2.4.1 试剂的配制

脂质体PBS分散系（LLS）：300 mg卵磷脂溶解于30 mL 10 mmol/L pH=7.4磷酸盐缓冲液（PBS），超声波处理30 min，冰浴保存；三氯乙酸-硫代巴比妥酸-盐酸（TCA-TBA-HCl） 混合液∶15 g TCA，0.375 g TBA，2.1 mL浓盐酸依序溶于100 mL水中。

2.4.2 抑制脂质体过氧化能力的测定

于样品管中依次加入1 mL LLS、1 mL 400 μmol/L硫酸亚铁溶液、1 mL样品，混匀，避光，于37℃水浴中保持60min，再加入2mLTCA-TBA-HCl混合液，100℃水浴中反应15 min，冰水中迅速冷却，以4000 r/min转速离心10 min，取上清液在535 nm测定吸光值As。空白管以1 mL去离子水代替1 mL样品，操作方法同样品管,可测得空白管的吸光度Ac。根据下列公式计算抑制率 S=[(Ac-As)/Ac]×100%。

3 结果与分析

3.1 夏枯草多糖提取的工艺条件

夏枯草多糖提取的工艺条件见表2。

表2 正交试验设计及结果Table 2 The orthogonal design experiment and results of polysaccharide extraction

从表2可以看出，时间、温度和料液比对总糖和多糖提取率影响较大，而对还原糖提取率几乎无影响，说明夏枯草多糖耐热性好，受提取温度和时间影响小。正交试验及极差分析结果表明各因素对夏枯草多糖提取率影响的顺序为：料液比＞温度＞时间。最优水平组合为温度90℃,提取时间4 h，料液比1∶35（g/mL），多糖提取率5.39%。

3.2 夏枯草多糖对羟基自由基的清除活性

夏枯草多糖对羟基自由基的清除活性见图1。

在生命活动的氧化代谢过程中不断产生各种自由基，·OH和超氧阴离子自由基具有广泛代表性，后者形成最早，前者的反应活性最强，对机体危害最大[13]，因为·OH是仅次于F-的强氧化剂，几乎可以和所有的细胞组分(核酸、蛋白质和脂质等)发生反应，对于筛选、评价具有清除自由基能力的生化药品和功能食品有着重要意义。图1显示，夏枯草多糖具有较强的自由基清除活性，在多糖浓度为0.8 mg/mL时，清除率达96.25%。在一定的浓度范围内，夏枯草多糖的羟基自由基清除活性随浓度的增加而增强，当多糖浓度超过0.9 mg/mL时，效果却相反。该多糖·OH清除活性高于一般其它植物多糖，而且浓度过高，效果却越差，这也与其它植物多糖不同[14]，有待进一步研究。

3.3 夏枯草多糖对DPPH自由基的清除活性

夏枯草多糖对DPPH自由基的清除活性见图2。

DPPH自由基是一种稳定的非水溶性化学自由基，常用来评价活性物质对自由基的清除能力[15]。图2显示，不同浓度夏枯草多糖对DPPH自由基清除活性随时间的延长而增强，当时间超过35 min时，自由基清除率几乎不再增加。DPPH自由基清除率也是随浓度的增加而增加，当超过0.7 mg/mL时，清除率降低，与羟基自由基清除效果一致。当浓度为0.5 mg/mL，在35 min时，DPPH自由基清除率最高，达68.81%。

3.4 夏枯草多糖抑制脂质过氧化作用

夏枯草多糖抑制脂质过氧化作用见图3。

选择常用的由Fe2+引发的卵磷脂磷酸缓冲液分散系，通过检测卵磷脂的氧化产物——过氧化物经分解产生的二级产物丙二醛来衡量脂质体的氧化程度。在酸性条件下，卵磷脂可被·OH氧化损伤产生丙二醛（MDA）类似物，硫代巴比妥酸（TBA）可与MDA类似物反应生成粉红色物质，该物质在532 nm处有最大光吸收，加入夏枯草多糖后，可有效抑制MDA的生成，进而反映夏枯草多糖的抗脂质过氧化作用。图3显示，在所测定的浓度范围内，夏枯草多糖对由Fe2+引发的卵磷脂分散系过氧化的抑制能力均随其浓度的增大而增大，在其加入量较小(浓度较低)时，加入量与清除率表现出量效关系，当浓度增大到一定值时，清除率随浓度的增加而呈微小变化。

4 结论

经正交设计试验优化，用水提醇析法提取夏枯草多糖的最佳工艺条件为：提取温度90℃，料液比1∶35（g/mL），提取时间 4 h，多糖提取率可达 5.39%。夏枯草多糖对羟自由基·OH和·DPPH的清除作用较强，前者在浓度为0.8 mg/mL时，清除率达96.25%，后者浓度为0.5 mg/mL，达68.81%。两者的清除能力随着夏枯草多糖浓度增加而升高，并呈明显的量效关系，但当浓度超过一定值时，结果却相反。夏枯草多糖对卵磷脂脂质过氧化损伤有显著抑制作用，也呈现明显的量效关系。为夏枯草作为天然抗氧化剂的应用奠定了理论基础，而夏枯草多糖中主要表现抗氧化活性的具体级分和构效关系有待进一步研究。

[1]景亚武,易静,高飞，等.活性氧：从毒性分子到信号分子-ROS与细胞的增殖,分化和凋亡及其信号转导途径[J].细胞生物学杂志,2003,25(4)：197-202

[2]VALKO M,LEIBRITZ D,MONCOLAFREE J，et al.Free radicals andantioxidantsinnormalphysiologicalfunctionsandhumandisease[J].The International Journal of Biochemistry&Cell Biology，2007,39(1)：44-84

[3]LU T,FINKEL T.Free radicals and senescence[J].Experimental Cell Research,2008,314(9)：1918-1922

[4]PAN YM,L IANG Y,WANG H S,et al.Antioxidant activity of severalChinesemedicineherbs[J].FoodChemistry,2004,88(3)：347-350

[5]李姣娟,黄克瀛,龚建良,等.油茶叶乙醇提取物清除DPPH自由基作用的研究[J].林产化学与工业,2008,28(2)：82-86

[6]冯怡,薛明,姜玲,等.海夏枯草中水溶性多糖的分离纯化及化学研究[J].中国医院药学杂志2008,28(6)：431-435

[7]封亮，贾晓斌，陈彦夏，等.枯草化学成分及抗肿瘤机制研究进展[J].中华中医药杂志,2008,23(5)：428-434

[8]张惟杰.糖复合物生化技术[M].浙江：浙江大学出版社，1999：9-12

[9]程超,李伟,莫开菊,等.不同火棘多酚的体外自由基清除作用[J].中国酿造,2008(10)：39-42

[10]QIAN JY,LIU D,HUANG AG.The efficiency of flavonoids in polar extracts of lycium chinense mill fruits as free radical scavenger[J].Food Chemistry,2004,87(2)：283-288

[11]吕晓玲,邱松山,孙晓侠,等.油茶总皂苷的抗氧化及清除自由基能力初步研究[J].食品科学,2005,26(11)：86-90

[12]OCK-SOOK Y,MEYER AS,FRANKEL E.AntioxidantActivity of GrapeExtractsinaLecithinLiposomeSystem[J].JAOCS,1997,74(10)：1301-1306

[13]Halliwell B.Reactive oxygen species and the central nervoussystem[J].J Neurochem,1992,59(5)：1609-1623

[14]王新，何玲玲，刘彬.苦丁茶冬青叶多糖的分离纯化及其对羟自由基的清除作用[J].食品科学,2008,29(6)：37-40

[15]BONDET V,BRAND-WILLIANS W,BERSET C.Kinetics and mechanisms of antioxidant activity using the DPPH free radical method[J].Lebensmittel-Wissenschaft und-Technology,1997,30(6)：609-615

Free Radical-Scavenging and Antioxidant Activity of Polysaccharide from Prunella Vulgaris Linn

XIONG Shuang-li,LI An-lin
（College of Life Science and Engineering，Southwest University of Science and Technology，Mianyang 621010，Sichuan,China）

2010-05-20

西南科技大学国防重点学科实验室重点培育项目(07JGZB18)

熊双丽（1977—），女（汉），副教授，博士，研究方向：碳水化合物与生物技术。