扶正活血不同组方大鼠含药血清对HSC-T6增殖的影响＊

王者令，刘中景，宋 霆，罗玮敏，孙晓慧

（青岛市传染病医院，山东 青岛 266033）

1 材料与方法

1.1 实验药品

中药：购置于广州中医药大学第一附属医院中药房，经广州中医药大学中药学院鉴定教研室鉴定。

中药以“桃红活血汤”为基本方（赤芍、丹参、桃仁、红花），并结合2006年8月中国中西医结合学会肝病专业委员会《肝纤维化中西结合诊疗指南》临床肝硬化常见辨证分型，以肝郁脾虚、肝肾阴虚、脾肾阳虚3种分型为“扶正”组方，组成扶正活血共3个不同方剂（简称1号方、2号方、3号方）。

1号方（活血化瘀健脾益气）：桃红活血汤加黄芪、党参、白术、炙甘草；2号方（活血化瘀滋养肝肾）：桃红活血汤加熟地、白芍、麦冬、枸杞子；3号方（活血化瘀温补脾肾）：桃红活血汤加附子、干姜、炙甘草、肉苁蓉、菟丝子。

药物制备：将扶正活血方原药浸泡20min（水浸过药面2cm），武火煮沸后改用文火煎30min，冷却30min后滤渣取汁，将滤渣如上法再煎煮2次取汁。将2次药汁混合，用文火适度，浓缩至120ml，浓度为0.75kg/L，制成扶正活血方大剂量水煎剂，置冰箱4℃备用。

西药：秋水仙碱（昆明制药集团有限公司），购于广州中医药大学一附院西药房。

秋水仙碱灌胃药液的制备：秋水仙碱，成人（60kg）的日用量为1mg，大鼠的剂量为成人用量的30倍（即0.25mg/kg），使用时以蒸馏水调制药液成0.025g/L。

1.2 动物及试剂

SD大鼠购自广州中医药大学实验动物中心，HSC-T6细胞由广州中医药大学热带病研究所提供，RPMI1640培养基为美国GIBCO公司，注射用青霉素钠、注射用硫酸链霉素为哈药集团制药总厂，小牛血清为杭州四季青生物工程材料有限公司，Trypsin 1∶250（胰蛋白酶）为美国 Difco公司，EDTA为美国GIBCO公司，PI为美国 SIGMA公司，RNase为美国SIGMA公司，MTT为美国SIGMA公司。

1.3 含药血清动物分组及标本采集

将SD大鼠随机分为正常血清对照组（简称正常组）、秋水仙碱对照组（简称阳性组）、扶正活血组（1号 ～3号组）共5组，每组6只；以上各组均以相应的药物灌胃（正常血清对照组以生理盐水灌胃），灌胃量均为1ml/l00g体质量.每天灌胃2次，间隔12h，连续给药 3d。

末次给药后1h采血（灌药前禁食不禁水12h），10g/L戊巴比妥钠（0.35mL/100g）腹腔麻醉，腹主动脉采血，室温下静置4h，3000r/min离心15min，分离血清，同组血清相混，将各组血清用56℃水浴灭活30min，以除去可能存在的生物活性物质，再用0.22pm微孔滤膜过滤除菌，置 －20℃冰箱保存备用。

1.4 HSC-T16细胞分组及各组工作液的配制

将对数分裂期的HSC-T6细胞接种入培养板后，以孔为单位，先按以上大鼠血清分组，每大组又按工作液中的含药血清浓度（50、100、200ml/L的含药血清分为3个小组，每小组设5个复孔。

低浓度小组（含50ml/L正常大鼠血清）：10μl正常大鼠血清 +190μl DMEM；中浓度小组（含100ml/L正常大鼠血清）：20μl正常大鼠血清 +180μl MEM；高浓度小组（含200ml/L大鼠血清）：40 μl正常大鼠血清+160μl DMEM。

1.5 MTT比色法检测肝纤维化HSC-T6增殖

取对数生长期的HSC-T6细胞，在96孔板中培养12h，加入不同浓度的扶正活血方含药血清，培养48h，MTT法测定细胞增殖抑制率。

（1）待HSC-T6细胞生长融合成单层后，用2.5g/L胰蛋白酶消化，并接种至无菌96孔板内，细胞接种密度约为5 x 106个/L，每孔加入细胞悬液200μL，继续培养；（2）在 37℃、50mL/L CO2培养箱中培养24h后，加入无血清 DMEM培养液（每孔200μL）培养24h，使细胞同步化于静止期；（3）弃上清，各孔按实验分组要求加入相应的工作液，移入细胞培养箱继续培养48h；（4）48h后取出培养板，每孔加入 MTT溶液 20μl，37℃、继续培养 4h后，小心吸去上清，每孔加入DMSO 200μl，室温下，用微型超声振荡器混匀。

1.6 结果判定

用酶标仪（波长为570nm，参比波长为450nm）测定每组细胞A值，重复3次。按以下公式计算细胞抑制率：抑制率=（1－实验组平均A值/对照组平均A值）×100％。

1.7 实验数据统计分析

2 结果

表1、图1显示，各组含药血清低浓度小组和中浓度小组，对HSC-T16细胞增殖抑制率很低，只在其高浓度时显示有不同程度的抑制效果。与正常对照组比较，扶正活血各组方动物含药血清对 HSCT16细胞增殖抑制率均有显著性意义（P＜0.01），而和阳性药物组比较则无显著性差异。

表1 各组高浓度含药血清对HSC-T6增殖抑制率±s）

表1 各组高浓度含药血清对HSC-T6增殖抑制率±s）

注：与正常组比较：△△P＜0.01

组别OD值（570nm） 抑制率（％）0.98±0.19 0秋水仙碱组 0.46±0.05△△ 49 1 号 方 组 0.32±0.07△△ 67 2 号 方 组 0.44±0.05△△ 49 3 号 方 组 0.64±0.13△△正常对照组30

3 讨论

HSC是用SV-60转染原代培养15d的大鼠HSC建立起来的，它保留了所有激活HSC的特点，可以表达结蛋白、α-平滑肌肌动蛋白和胶原纤维酸性蛋白，至少传40代仍能保持稳定的表型［1］。对目前应用HSC-T6进行的多项研究证明，它与原代培养的HSC生物性状基本一致，其增殖能力较强，进入对数生长时间较早，且对数生长期持续时间较长，易于培养和维持，具有很高的稳定性，是一个良好的进行药理学细胞水平研究的模型［2～3］。活化 HSC数量的增加是肝纤维化形成的中心环节，而近年来研究证实［4］，中医扶正活血治则均有抑制 HSC增殖的作用。本研究结果显示，扶正活血不同组方的含药血清对HSC的增殖有明显抑制作用。

［1］Niteo N，Frideman SL，Green wel p，et al.Cyp21 mediated oxidative stressinduces collaten type 1 xwpression in rat hepatic stellate cells［J］.Hepatology，1999，30：987-996.

［2］Ankoma-sey V，Wang Y，Dai Z，Hypoxic stimulation of vascular endothelial growth factor expression in activated rat hepatic stellate ce1ls［J］.Hepatology，2000，31：141-148.

［3］Coats S，Flanagan WM，Nourse J，et al.Equirement of p27 Kipl for restriction point control of the fibroblast cell cycle［J］.Science，1996，272：877.

［4］蔡锐，伍参荣，胡海平，等.桃红四物汤加丹参对肝星状细胞增殖和凋亡影响［J］.湖南中医学院学报，2005，25（6）：22-24.