杜仲总黄酮对人肺腺癌细胞H1299细胞增殖的影响

邓宏宇

（遵义医学院中心实验室 贵州遵义563000）

近年来，国内外许多学者对杜仲的化学成分和药理作用进行了大量研究。研究证明,杜仲中含有黄酮类、环烯醚萜类、木脂类、三萜类、甾醇、糖类化合物和有机酸、醇、微量元素等多种功能成分[1]。其中，杜仲中黄酮类化合物的含量,是判断杜仲生药及其相关产品的重要指标。黄酮类化合物具有抑菌消炎、抗氧化、抗衰老、抗癌防癌等诸多功效[2]。

本实验通过经醇提取的杜仲总黄酮成分对人肺腺癌细胞H1299细胞的作用,观察杜仲总黄酮对H1299细胞增殖的影响，为杜仲抗肿瘤的药效成分筛选以及杜仲的进一步开发利用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂杜仲皮 采自贵州省正安县城关镇田生村，经遵义医学院药学系鉴定确认系杜仲皮。人肺腺癌细胞H1299：由生化教研室范芳副教授惠赠。DMEM培养基为Gibco公司产品;胎牛血清购自四季青生物公司;胰蛋白酶为国药集团试剂有限公司产品;MTT为Sigma公司产品；芦丁标准品购自北京中国药品生物制品检定所。

1.2 主要仪器 酶联免疫检测仪Bio-Tek instruments公司制造，超净工作台由苏州净化制造，二氧化碳培养箱由美国Thermo公司制造。

1.3 杜仲总黄酮的提取[3]杜仲皮制成粉状,采用乙醇分段(60%~90%)提取法,醋酸铅胺沉淀过滤,浓缩后过大孔树脂、聚酰胺和硅胶柱，过柱样品与标准品芦丁对照,测得总黄酮含量为73%。用DMEM培养 液 制 备 总 黄 酮 浓 度 分 别 为 25μg/ml、50μg/ml、100μg/ml、200μg/ml的药液,调 pH 至 7.2~7.4 后过滤除菌。

1.4 H1299细胞的培养 复苏液氮冻存的H1299细胞，加入含10%胎牛血清的DMEM培养液，接种于细胞培养瓶中，置37℃、5%CO2培养箱中培养，待细胞到达对数生长期后，用于实验。

1.5 MTT法检测H1299细胞增殖抑制 将处于对数生长期的H1299细胞用0.25%的胰酶消化成单细胞悬液，调整浓度为2×104个/ml,接种于96孔板中,每孔200ul。培养24h后弃掉原培养液,分别加入杜仲总黄酮浓度为 25μg/ml 、50μg/ml、100μg/ml、200μg/ml培养液各200μl,另设一组只加培养液而不加黄酮为对照组,每组重复6孔。在加黄酮48h后,每孔加入5mg/ml的MTT 20μl,继续培养4h后小心吸出培养液,每孔再加入150μl二甲基亚枫(DMSO)作用10min,酶联免疫检测仪上490nm波长测各孔吸光值,结果用OD490表示。

用如下公式计算细胞增殖抑制率：

1.6 统计学处理 所有数据用SPSS（13.0）统计软件进行方差分析，结果用±s表示，P<0.05表示有统计学意义。

2 结果

与对照组比较,杜仲总黄酮为 25μg 、50μg、100μg、200μg/ml剂量组的 OD490吸光值均降低,浓度为 25μg 、50μg、100μg、200μg/ml的总黄酮均能抑制H1299细胞的增殖，作用效果具有较明显的量效关系，与对照组比较有统计学意义（P＜0.05）。详见附表1。

表1 杜仲总黄酮对H1299细胞的增殖抑制作用

3 讨论

肺癌是最常见的恶性肿瘤之一,发病率有逐年增高的趋势。肺癌常规化疗效果不甚理想,传统抗癌药难以避免选择性差、毒副作用强等缺点,因此，一些天然物质及其衍生物对肿瘤的诱导分化和凋亡作用越来越受到重视[4]。

杜仲是为中国特有的贵重中药材,早在《神农本草经》就记载了杜仲的药效:“杜仲性味甘、微辛、温、无毒,有补肝肾、强筋骨、益腰膝、除酸痛的效能”。近代医学又证明了杜仲具有降压、降血脂、降血糖、抗氧化、抗衰老、抗肿瘤、抗病毒、抗真菌防霉、抗骨质疏松作用等等。

杜仲的主要功效成分有木脂素类、环烯醚萜类、苯丙素类、黄酮类、多糖类、杜仲抗真菌蛋白。本实验通过提取杜仲皮中的总黄酮，直接作用于体外培养的人肺腺癌细胞H1299，初步观察杜仲总黄酮的抗肿瘤作用。实验结果表明，杜仲总黄酮浓度在25μg、50μg、100μg、200μg/ml 时 ， 均 能 抑 制 肺 癌 细 胞H1299增殖，与对照组相比，有统计学意义（P<0.05）。且随着浓度的升高，其抑制增殖的作用不断增强，有较明显的量效关系。MTT法对细胞增殖测定的原理是利用细胞中线粒体能量代谢过程中产生的琥珀酸脱氢酶，将淡黄色的四甲基氮唑盐MTT还原成蓝紫色不溶于水的formazan结晶,形成的结晶与活细胞数量成正比,该结晶经DMSO溶解,能在波长490nm处形成吸收峰[5],故用该波长测定溶液的吸光度(OD)值,便能了解细胞的增殖情况。

在本实验中,用不同浓度的杜仲总黄酮作用于H1299细胞，发现均对该细胞的增殖有抑制作用，初步说明杜仲总黄酮有直接抑制肿瘤细胞H1299增殖的作用。实验提示，杜仲中总黄酮是其抗肿瘤成分之一。然而，杜仲总黄酮抗肿瘤活性的具体机制还有待进一步研究。

[1]盛军利,孙桂菊.杜仲的功效学研究现状及其应用前景[J].医学综述,2006,12(16):1022-1024.

[2]张德权,台建祥,付勤.生物类黄酮的研究及应用概况[J].食品与发酵工业,1999,25(6):52-57.

[3]肖静,李三华,莫宁萍,等.杜仲总黄酮对体外培养大鼠成骨细胞增殖的影响 [J].遵义医学院学报，2008，31（3）：238-240.

[4]RaskatovasD.Chemop revention possibilities of lung cancer[J].Medicina(Kaunas),2004,40(12):1151-1157.

[5]林忠宁，董胜，董书芸，等.MTT法检测T淋巴细胞增殖功能的方法学探讨与应用 [J].中国卫生检验杂志，2000，10（1）：8-10.