激光共聚焦显微镜检测紫花地丁水浸出物对HBV的影响

王 玉，吴中明，罗 果，王美丽

（遵义医学院，贵州 遵义563003）

紫花地丁(Viola Yedoensis Makino)属堇菜属,传统医学认为紫花地丁味苦、性寒,具有清热解毒,抗菌消炎的功效。临床上，紫花地丁及含有紫花地丁的方剂主要用于治疗各种病原体感染,特别是慢性感染和自身免疫性疾病[1]。激光共聚焦显微镜(laser confocal scanning microscopy,LSCM)是一种新型高精度的激光源加共聚焦显微镜,可对活的或固定的细胞及组织标本的荧光定量分析,离子含量的实时动态分析检测等。本实验利用LSCM与间接免疫荧光结合，观察紫花地丁对乙型肝炎病毒 (Hepatitis B virus,HBV)DNA全基因转染的HepG2.2.15细胞[2，3]内的HBsAg、HBeAg和HBcAg的影响。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1 实验细胞 HepG2.2.15细胞株，购于解放军302医院传染病研究所病毒所。

1.2 主要仪器 激光共聚焦显微镜（Leica TCS SP2）。

1.3 主要试剂 ①MTT（华美生物工程公司）；②羊抗人-IgG-FITC（华美生物工程公司）；③抗-HBs、抗-HBe和抗-HBc免疫血清（华美生物工程公司）。

1.4 实验药物 ①紫花地丁水提取物储存液：称取100 g紫花地丁，切碎后加适量超纯水浸没紫花地丁，置于4℃冰箱浸泡过夜。次日加热煮沸，保持微沸浸出一定时间，重复煎煮3次，分离并收集各次煎出液，浓缩至250 mL溶液，浓度相当于每mL含400mg生药量，过滤除菌分装，置-20℃冰箱保存备用。②使用DMEM完全培养液配制各实验浓度药物。

1.5 实验方法

1.5.1 细胞培养 HepG2.2.15细胞用含10%婴牛血清、380mg/L G418（实验用培养液不加）、100U/mL青霉素、100U/mL链霉素、用0.238%HEPS的DMEM培养液培养，每4～5天换1次培养液，约7d传代1次。HepG2.2.15细胞为贴壁生长细胞，传代时用0.25%胰酶消化。

1.5.2 MTT法测细胞毒性 ①接种细胞：将生长良好的HepG2.2.15细胞以5×104个/孔的密度接种于96孔培养板，置于37℃、5﹪CO2培养箱中培养。②药物作用：HepG2.2.15细胞贴壁后经血清饥饿法进行细胞同步化后分组,实验组分别加入含有3、0.6和0.12mg/ml紫花地丁水浸出物的培养液；阳性对照3TC组的终浓度为50μg/mL；不加药物细胞对照组加入完全培养液。每孔均加入0.1 mL。每一浓度设5个平行孔。空白孔不加细胞，只加培养液。继续培养3d、6d和9d后，每3天更换含药培养液1次。③MTT法检测：实验结束后，采用酶标仪波长为490 nm（参考波长630nm）测定各孔A值[1]。按下列公式计算细胞破坏率和半数毒性剂量（TC50）。细胞破坏率(%)=[(细胞对照组平均A值-实验组平均A值)/细胞对照组平均A值)]×100%。TC50=Antilog[A+(50-50%抑制百分率)×C/>50%抑制百分率-<50%抑制百分率]注：(A=log<50%药物浓度,B=log>50%药物浓度,C=B-A)。

1.5.3 细胞爬片的制备 将生长良好的HepG2.2.15细胞用0.25﹪胰酶消化后制成细胞悬液，以3.5×105个/孔的密度接种于放有灭菌盖玻片的6孔培养板，置于37℃、5﹪CO2培养箱中培养。贴壁后经血清饥饿法细胞同步化处理后，进行实验分组：实验组加入3mg/mL紫花地丁水浸出物，阳性药物对照组3TC浓度为50 μg/mL；细胞对照组加入完全培养液，每孔均加入2.0 mL。继续培养3d后，取出爬片用PBS洗一次，冷丙酮固定10 min后，免疫荧光染色后上机检测。

1.5.4 细胞爬片荧光染色法 已固定的细胞爬片用PBS洗5 min，在标本上覆盖1：5的抗-HBe、抗-HBs免疫血清，4℃冰箱中孵育过夜→用PBS漂洗3×3 min→细胞未干前复加二抗（羊抗人IgG-FITC 1:8）37℃湿盒1h→用PBS漂洗3×3 min→PI室温避光作用15 min→用PBS漂洗3×3 min→封片剂封片后用LSCM观察，并进行荧光强度的定量分析。FITC和PI的激发波长分别是488nm和535nm。FITC检测HB sAg、HBeAg和 HBcAg；PI检测细胞核酸。

加抗-HBc前先用0.1﹪Triton X-100+10﹪小牛血清PBS溶液37℃孵育15 min，余步骤同上。

计算抗原抑制率,公式如下:抗原抑制率＝（细胞对照组荧光强度－药物处理组荧光强度）/细胞对照组荧光强度×100%。

1.6 统计学处理 采用SPSS 13.0统计软件分析数据，组间比较采用方差分析，各均数两两比较。

2 结果

2.1 紫花地丁的细胞毒性作用 在加入不同浓度的紫花地丁水浸出物和50μg/ml 3TC作用3d、6d和9d后，在倒置显微镜下观察各紫花地丁水浸出物组细胞生长良好。MTT实验发现紫花地丁水浸出物各浓度组均有不同程度促细胞生长作用 (P<0.05)，50μg/mL 3TC在第9天有明显细胞毒性作用（P<0.05）。

2.2 HBsAg、HBeAg和 HBcAg在 HepG2.2.15细胞内的定位 LSCM下,HBsAg主要存在于细胞的胞浆、核膜和胞膜上；HBeAg主要在核内和胞浆内，核膜上没有分布；HBcAg分布在胞浆和核内（见图1）。

表1 紫花地丁水浸出物、3TC在HepG2.2.15细胞培养中对细胞的作用(OD 490nm,±s,n=5)Tab.1 The cell toxicity of the different concentrations of Viola Yedoensis Makino extract and 3TC on HepG2.2.15 cells.(OD 490nm,±s,n=5)

表1 紫花地丁水浸出物、3TC在HepG2.2.15细胞培养中对细胞的作用(OD 490nm,±s,n=5)Tab.1 The cell toxicity of the different concentrations of Viola Yedoensis Makino extract and 3TC on HepG2.2.15 cells.(OD 490nm,±s,n=5)

注：与细胞对照组比较:*P<0.05,**P<0.01;紫花地丁水浸出物各浓度组与3TC组比较：△P<0.05,△△P<0.01

?

图1 激光共聚焦显微镜下HepG2.2.15细胞内HBsAg、HBeAg和HBcAg的分布（×200）Fig 1 Location of HBsAg,HBeAg and HBcAg in HepG2.2.15 cells by LSCM（×200）

2.3 药物对细胞内HBsAg、HBeAg和HBcAg的影响 药物处理3d后采用间接免疫荧光法标记HBs Ag、HBeAg和HBcAg，并随机选取5个视野，记录100个细胞的荧光强度。结果表明，紫花地丁水浸出物3mg/ml组对三种抗原均有抑制作用（P<0.01）；3TC 50μg/mL组对HBsAg和HBeAg有明显抑制作用（P<0.01），但对 HBcAg无抑制作用（P>0.05）。两种药物对HBsAg抑制作用无显著差异（P>0.05），紫花地丁水浸出物对HBeAg和HBcAg抑制作用更强（P<0.05）。

3 讨论

本试验主要研究紫花地丁水浸出物对HepG2.2.15细胞内HBsAg、HBeAg和HBcAg的影响以及三种抗原在细胞内的分布，为进一步了解紫花地丁对HBV的作用打下实验基础。本研究将紫花地丁作用的细胞爬片，用抗-HBs、抗-HBe和抗-HBc特异性标记细胞内的相应抗原，再用羊抗人IgG-FITC标记一抗，在LSCM下直接观察HBV抗原含量的变化。LSCM的激发光源为单波长的激光，因而能有效地避免细胞的自发荧光和非特异性荧光的出现，使所采集的图像更清晰可靠[4,5]；同时，由于LSCM采集的是一个光学层面的图像，所以能够准确地定位出三种抗原在HepG2.2.15细胞内的分布。结果表明HBsAg主要分布在胞浆和胞膜，HBeAg分布在核内、胞浆和胞膜，HBcAg主要分布在核内和胞浆内。

表2 紫花地丁水浸出物和3TC在第3天对HepG2.2.15细胞内的HBsAg、HBeAg和HBcAg的影响Tab 2 The effect of Viola Yedoensis Makino estract and 3TC on HBsAg,HBeAg and HBcAg in HepG2.2.15 cells at 3th day.

我们曾证实紫花地丁对HepG2.2.15细胞分泌的HBsAg和HBeAg具有抑制作用[6]，本研究拟观察紫花地丁对HepG2.2.15细胞内 HBsAg、HBeAg和HBcAg的影响。结果表明紫花地丁对细胞内三种抗原均有明显抑制作用，其中对HBeAg的抑制作用优于拉米夫定。HBeAg是HBV复制及具有强感染性的一个指标,对于病毒在感染宿主中的生命周期至关重要，同时也是病毒基因的辅助产物。紫花地丁对胞内外HBeAg均有抑制作用，表明紫花地丁对HBV复制具有一定的抑制作用。本研究发现紫花地丁对HBcAg具有抑制作用，而拉米夫定无抑制HBcAg作用，HBcAg较HBsAg和HBeAg更能反映HBV的存在及其复制程度，它是HBV颗粒存在的直接标志，其与HBV DNA呈正相关，都可反映HBV的活动性复制。紫花地丁对HBcAg具有抑制作用,进一步说明其对HBV具有抑制作用。紫花地丁作用导致HBsAg、HBeAg和HBcAg含量减少说明其具有一定的抗HBV作用，但其作用机制还需进一步研究。

激光共聚焦显微镜现已广泛用于病毒的荧光定量测量，共焦图像分析等方面的研究，今后必将在抗病毒药物筛选中发挥越来越重要的作用。

[1]李海涛，杨琳，章广玲，等.紫花地丁煎剂调节小鼠巨噬细胞功能的体内实验研究 [J].华北煤炭医学院学报，2004，6（5）：553-554.

[2]Jia-Ming Chang,Kai-Ling Huang,Thomas Ta-Tuan,et al.The anti-hepatitis B virus activity of Boehmeria nivea extract in HBV-viremia SCID mice[J].eCAM,2007,1-7.

[3]张玮，王育群，季光，等.芪黄冲剂体外（2.2.15细胞）抗病毒的药效学研究 [J].现代中西医结合杂志，2005，14（9）:1137-1140.

[4]周继凯,李焕德.激光扫描共聚焦显微技术在医药研究中的应用[J].中南药学,2007,5(1):66-68.

[5]朱菁,李秀兰,李惠芬.激光扫描共聚焦显微技术及在药学上的应用[J].天津药学,2006,18(5):58-61.

[6]王玉,吴中明,敖弟书,等.紫花地丁对HepG2.2.15细胞分泌 HBsAg 的影响[J].遵义医学院学报，2009，32（6）：559-566.