先天性心脏病圆锥动脉干畸形NKX2-5基因Cp G岛甲基化状态分析

盛伟 王慧君 马晓静 李文灿 陈龙 张进 黄国英 马端，，*

（1.复旦大学上海医学院分子医学教育部重点实验室，上海 200032；2.复旦大学生物医学研究院，复旦大学出生缺陷研究中心，上海 200032；3.复旦大学附属儿科医院，复旦大学儿童发育与疾病转化医学研究中心，上海 200032；4.复旦大学法医系，上海 200032）

先天性心脏病（congenital heart disease），简称先心病，是指胚胎发育过程中心脏结构发生异常的一类疾病。近年来出生缺陷调查资料显示，先心病已跃居我国出生缺陷畸形首位，发病率占活产新生儿的6‰～10‰［1］。圆锥动脉干畸形（congenital heart conotruncal defects，CTD）是先心病中最为严重的一种类型，约占先心病的30%［2］。CTD是指在遗传和环境因素的共同作用下，胚胎发育早期心脏流出道和大动脉发育异常，临床上表现为法洛四联症、肺动脉闭锁、大动脉转位、右室双出口、永存动脉干等多种复杂心血管畸形，常出现紫绀和低氧血症，是造成我国婴儿和新生儿死亡最主要的原因之一。

心脏特异性转录因子NKX2-5高度保守，是脊椎动物心脏育生中较早表达的转录因子，是心脏前体细胞最早的标志物，参与心脏发育的整个过程。NKX2-5自胚胎发育第7.5天开始持续表达，其正常表达对心脏的环化、心房及心室发育、动脉干分隔、房室瓣形成及房室传导的维持均起重要作用［3］。动物实验显示，NKX2-5参与了胚胎心脏发育，是引起心脏畸形的关键因素，敲除NKX2-5基因的小鼠胚胎在10.5天由于心脏缺失而死亡［4］。临床研究显示，NKX2-5基因在患儿人群中发生突变的比例非常低，如法洛四联症和房间隔缺损患者中仅有4%发生突变［5］。最近也有学者提出，基因序列的改变不是NKX2-5引起心脏畸形的主要原因［6］。

除了编码序列改变可以导致基因的功能异常以外，基因启动子区域的甲基化变化也可以影响基因的表达，从而使所编码的蛋白出现量的差异。本研究拟通过比较该基因在正常心脏组织与CTD病变组织中的甲基化状态的差异，了解NKX2-5基因的甲基化状态与CTD的关系，为先心病的早期基因诊断提供理论依据。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 主要试剂 Tru1l限制性内切酶购自Fermentas公司，IPTG购自Promega公司，蛋白酶抑制剂购自Sigma公司，Glutathione Sepharose 4B购自GE Healt hcare公司，组织基因组DNA提取试剂盒购自AXYGEN公司，PCR产物回收试剂盒购自QIAGRN公司，LA Taq聚合酶、T4 DNA连接酶和实时定量PCR试剂均购自Ta KaRa公司，所有引物均在上海桑尼生物公司合成。含有PET4-GST-MBD重组质粒的大肠杆菌为本实验室保存。

1.1.2 研究材料 正常儿童心脏组织取自复旦大学法医学系。圆锥动脉干畸形病变组织由复旦大学附属儿科医院提供。本研究涉及的人体组织样本均经所有研究对象签署知情同意书。

1.2 方法

1.2.1 NKX2-5基因启动子区Cp G岛预测及Real Time PCR引物设计 登陆http：／／genome.ucsc.edu／网站，查找人的NKX2-5基因启动子区，通过甲基化分析软件（Methyl Primer Express v 1.0）确定启动子区的Cp G岛位置，根据Tru1l限制性内切酶的酶切位点，确定Real Time PCR的扩增区域，然后利用引物设计软件（primer premier 5）设计Real Time PCR引物。

1.2.2 基因组片段化与接头连接 组织样品基因组DNA按照QIAGEN公司的组织基因组DNA提取试剂盒步骤进行提取。取正常心脏组织和CTD病变组织基因组各1μg，利用Tru1l限制性内切酶进行酶切，反应体系为：各基因组1μg，Tru1l酶1μL，10×buffer 2.5μL，补加灭菌蒸馏水至终体积为25μL，再加入10μL石蜡油防止蒸发，反应条件为65℃3～4小时，利用酶切回收试剂盒对酶切产物进行回收。接头引物序列为：H-24，5-AGG CAA CTG TGC TAT CCG AGG GAT，H-12，5-TAA TCC CTC GGA。各取200μM的接头引物100μL，94℃5分钟，然后将2种引物汇合，自然冷却形成接头。利用T4 DNA连接酶，将基因组DNA酶切回收产物与制备的接头进行连接，反应体系为：10×T4 buffer 5μL，酶切回收产物 10μL，接头 2μL，PEG4000 4μL，T4连接酶2μL，补加灭菌蒸馏水至终体积为50μL，反应条件为16℃，过夜。

1.2.3 GST／MBD融合蛋白的表达纯化及活性检测将含有PET4-GST-MBD重组质粒的大肠杆菌在LB-Kan平板上进行划板，37℃培养过夜；挑取单克隆，接种于10ml LB-kan液体培养基中；次日将培养液接种于200ml LB-kan液体培养基中进行扩大培养；用终浓度为1m M的IPTG诱导3～4小时以表达GST／MBD融合蛋白，分别在1.5小时（诱导前）、4小时（诱导后）取待检测样品，通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳和考马斯亮蓝染色检测诱导表达结果。200ml诱导后菌液离心后悬浮在PBS-T（1%Triton X-100）缓冲液中，此缓冲液中含有终浓度为1m M的PMSF和50mg／ml的溶菌酶，冰上放置30分钟，超声破碎细胞，溶解产物经高速离心，上清过Glutathione Sepharose 4B层析柱，并用10倍柱体积的PBS洗去非特异性结合的蛋白，用低盐浓度结合缓冲液洗去大肠杆菌DNA，最后获得纯化的GST／MBD蛋白［7］。本实验室前期研究已证实，采用不同的盐离子强度的缓冲液进行洗脱，可以把甲基化的DNA和非甲基化的DNA分开，实验条件为：100m M NaCl缓冲液为结合缓冲液，500m M NaCl缓冲液为洗涤缓冲液，1 000m M NaCl的缓冲液为洗脱缓冲液［8］。

1.2.4 基因组中甲基化DNA富集 取GST／MBD蛋白层析柱100μL，离心去上清，用100μL 500m M NaCl的洗涤缓冲液平衡2次，在含有100m M NaCl的结合缓冲液中结合基因组DNA，放在摇床上4℃结合1小时。用500m M NaCl的缓冲液洗涤，以去除非甲基化DNA，最后用1 000m M NaCl的洗脱缓冲液洗脱并回收甲基化DNA。

1.2.5 LM-PCR扩增富集甲基化DNA 由于富集下来的甲基化DNA量较少，不能满足后续实验的要求，因此需要对富集的甲基化DNA进行有效的扩增。以富集的甲基化DNA为模板，H24为引物进行2轮LM-PCR扩增，从而获得足够量的富集甲基化DNA的PCR产物，用PCR产物回收试剂盒进行纯化回收，-20℃储存以备后续研究。

1.2.6 Real Time PCR检测样本中NKX2-5基因的甲基化状态 采用SYBR Green Real Time检测样本NKX2-5基因启动子区CpG岛的甲基化状态。实验中选取6例先天性圆锥动脉干畸形组织样本和1例正常心脏组织样本作为研究对象，各取100ng富集甲基化DNA LM-PCR产物为模板，以DXZ4为内参，利用比较定量法，根据Ct值与起始模板拷贝数呈线性关系，分析不同样本中Ct值的变化，每个样本重复3次，取其平均值。反应体系及反应条件严格按照试剂盒说明书进行。

2 结果

2.1 NKX2-5基因启动子区Cp G岛的预测及Real Time PCR扩增区域的确定 利用http：／／genome.ucsc.edu／网站及甲基化分析软件（Methyl Primer Express v1.0）确定NKX2-5基因转录起始点上游5kb内有3个Cp G岛（图1），根据Tru1l酶切片段的大小以及启动子区的确定，本研究选取了Cp G岛2中的1段，利用引物设计软件（primer premier 5）设计Real Time PCR引物，其上游引物为：GGCTTTGATGAGGGACAGGA，下游引物为CAAGGTGCGGAGGAAACG，产物长度为162bp。

图1 NKX2-5基因启动子区Cp G岛分布

2.2 基因组DNA片段化与接头连接分析 Tru1l酶切位点是TTAA，对基因组DNA进行酶切时可以保留绝大部分Cp G点的完整性，同时片段化基因组的大小集中在300～700之间（图2A），符合实验的预期目标。接头连接的成功与否直接关系到后续实验的成败。以连接产物为模板，H24为引物进行PCR扩增，琼脂糖凝胶电泳分析表明接头连接成功（图2B）。

2.3 GST／MBD融合蛋白的表达纯化 含有PET4-GST-MBD重组质粒的大肠杆菌，用IPTG诱导表达GST／MBD融合蛋白，SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳检测结果表明，在菌液的上清中有大量的融合蛋白表达，表达的融合蛋白经过Glutathione Sepharose 4B柱纯化，可以得到纯度较高的蛋白，其分子量大小与预期大小一致（图3）。

2.4 Real Time PCR检测结果分析 通过Real Time PCR检测，与正常心脏组织相比，不同CTD病变组织中NKX2-5基因的Ct值发生不同程度的改变（表1），其值变化范围在15～35之间，属于正常分析范围；根据其扩增曲线（图4）以及RQ柱状图分析（图5），样本T8、T11、T27和T76呈现高甲基化，分别是正常心脏组织样本的3.5、4.2、2.1和2.4倍，T6和T19则无明显变化。

图3 GST／MBD融合蛋白的表达和纯化

表1 正常心脏组织和不同病变组织样本中NKX 2-5基因Real Time PCR Ct值

图4 NKX2-5基因启动子甲基化Real Time PCR扩增曲线图

图5 NKX2-5基因启动子甲基化Real Time PCR RQ检测结果

3 讨论

人NKX2-5基因定位于染色体5q35，含2个外显子，编码324个氨基酸。NKX2-5基因位于众多对心脏发育有重要作用基因的上游，如TFGBR3、EDG7、BMP10、CX43、NPPA，以及最近发现的Etsrp71和Chibby等。应用原位杂交技术发现在NKX2-5基因纯合敲除小鼠中，Anp、MeCP2C、Carp等基因表达受到严重干扰［9］。同时，NKX2-5基因也受 Nodal、Shh／Ihh、Wnt、Notch和BMP2等多个早期胚胎发育相关的信号通路调节［10］。

NKX2-5基因启动子区存在多个具有重要功能的启动子、增强子，以及抑制因子和自动调节因子的结合元件。这些元件在与相应的转录因子结合后，在不同的时间和空间调控NKX2-5基因的表达。本研究利用甲基化结合蛋白（MBD）能够与甲基化DNA特异性结合的特性，将酶切后片段化的基因组甲基化DNA进行有效地富集，同时根据Real Time PCR中Ct值与起始模板拷贝数呈线性关系这种理论，利用SYBR Green Real Time PCR检测CTD样本和正常心脏样本中NKX2-5基因启动子区Cp G岛的甲基化状态。结果表明，该方法灵敏度高，准确性强，能够有效地检测出不同样本之间的甲基化状态。在所测的6例CTD组织样本中，与正常组织样本相比，4例呈现高甲基化，2例甲基化状态改变不明显。由此推断，NKX2-5基因表达异常可能与该基因启动子区甲基化有关。今后我们将扩大样本检测量，以进一步证实这个重要的现象。

总之，在本研究中，通过Real Time PCR检测，我们发现在CTD病变组织中NKX2-5基因启动子区Cp G岛发生了不同程度的甲基化，表明该基因启动子区Cp G岛甲基化可能与先心病的发生有关。同时，这种变化有可能对先心病的早期基因诊断有价值，值得进一步探索。

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