实验室常用生物安全设备的使用与维护

张燕婉叶 珏时 那宋 莉孟宪敏

实验室常用生物安全设备的使用与维护

张燕婉①叶 珏①时 那①宋 莉①孟宪敏①

为落实国家有关实验室生物安全的法规政策，提升实验室的管理水平，针对Ⅱ级生物安全防护医学实验室常用的生物安全柜、高压灭菌器、超净台和通风柜等防护设备，从设备的工作原理、操作规程和检定维护几方面进行了阐述, 从而强调了生物安全设备安全操作和规范管理的重要性和意义，并结合自身工作介绍了经验与体会。

实验室；生物安全；设备；使用；维护

实验室常用的生物安全设备主要有：生物安全柜、高压灭菌器、通风柜、超净台。国家根据实验室对病原微生物的生物安全防护水平（BSL），并依照实验室生物安全国家标准的规定，按操作的病原微生物危害程度从弱到强，将实验室分为一级、二级、三级和四级。三级、四级实验室必须经过国家批准并通过实验室国家认可(CNAS)，大多数实验室属于生物安全防护一级或二级实验室。我们可以根据所在实验室从事的生物实验风险评估确定的生物安全防护级别，选择相应的生物安全防护设备。

表1 实验室实验活动和生物安全的防护措施

1 生物安全柜(Biological safety cabinet,BSC)

从表1我们可以看出，从事生物实验主要产生的危害是有害气溶胶的产生，而生物安全柜是降低这一危害的最有效的办法。当我们实验的对象涉及原代培养物、菌毒种以及诊断性标本等具有潜在感染性材料时，都应在生物安全柜中操作。我们把具备气流控制及高效空气过滤装置的操作柜称为：生物安全柜，它能有效降低生物实验过程中产生的有害气溶胶(aerosols)对操作者和环境的危害，同时，还可以减少样本之间由于气溶胶产生的交叉污染。

1.1 生物安全柜的组成和工作原理

生物安全柜是由定向气流（风幕）、高效过滤器（HEPA）、风机压力系统和必需的在线监测仪表组成的箱形负压装置[1]。其中的HEPA过滤器起着重要的过滤阻挡气溶胶颗粒的作用。HEPA过滤器是一种一次性使用的、框架内有多重褶迭的干性材料的过滤器，能对0.3μm气溶胶颗粒有效过滤达99.97%，保证排出气体和内循环气体的无菌状态。图1是Ⅱ级生物安全柜的工作原理图：

当启动生物安全柜时，风机开始运转，房间内的空气经前窗开口A处进入生物安全柜内，经进气格栅进入风机系统F，鼓出的气流从安全柜后部进入柜体上方，分成两路。一路经上部的HEPA过滤器排放外界（房间/管道），另一路经HEPA过滤器E向下进入安全柜内，经过柜面再次经进气格栅进入下一个循环。这样反复带走污染空气，经过滤净化后再进行气体循环，确保了实验中环境和人员不被污染。

1.2 生物安全柜的种类

目前，我国将生物安全柜分为三个等级，即Ⅰ级、Ⅱ级、Ⅲ级，它们分别有各自的特点，下边分别进行叙述：

Ⅰ级生物安全柜：气溶胶排放大气前也经HEPA过滤器过滤，但过滤后的气体全部排放出去，柜内没有净化后循环气体。因此，这种安全柜只用于保护人员和环境不被污染，但不保护样品。

Ⅱ级生物安全柜：气溶胶经HEPA过滤器过滤后，一部分排放出去，一部分再次循环进入安全柜内，其中：前部开口区的吸入气流用以保护操作者的安全，经HEPA过滤的垂直气流用以保护样本，排出的气流经HEPA过滤是为了保护环境。因此，这种安全柜是真正的生物安全柜，它既保护环境、人员，也保护样本，是目前BSL-2实验室应用最多的生物安全柜。

表2 Ⅱ级和Ⅲ级生物安全柜的性能指标

Ⅲ级生物安全柜：为完全密闭的、不漏气结构的通风安全柜。送入气流经HEPA过滤器后过滤后进入安全柜内，排出的气流经双层HEPA过滤器或过滤和焚烧两次处理。人员通过与生物安全柜连接的密闭手套实施操作，安全柜内维持至少120 Pa的负压。这种安全柜适用于BSL-3实验室，生物危险等级Ⅳ级的高致病性病原微生物的操作。

1.3生物安全柜的正确使用

1.3.1 生物安全柜的使用要求

1.3.1.2 个人防护要求：

(1) 在使用生物安全柜时必须穿个人防护服；

(2) 必须戴手套，最后戴口罩和帽子，必要时戴防护口罩或面罩（如BSL-3实验室）；

1.3.1.3 生物安全柜内物品的摆放原则：

(1) 洁净区与污染区一定要严格分开，一般遵守从左到右为洁净区到污染区；

(2) 所用物品尽量放在柜内工作台的后面，前面留出操作空间；

(3) 前面的进气格栅要保证进气畅通，不要被实验物品挡住。

1.3.1.4 对紫外灯的要求：

定期更换灯管，确保紫外线的照射强度，保证杀菌效果。

1.3.1.5 避免使用明火：

明火会造成生物安全柜的气流紊乱，干扰气流模式，还会损坏HEPA过滤器。

1.3.1.6 实验室内应有备用风机和不间断供电，确保安全柜工作时负压不变。

1.3.2 生物安全柜使用前的准备工作

(1) 首先打开紫外灯照射30 min，消毒柜内台面；

(2) 关闭紫外灯，打开安全柜的风机，排走柜内的空气污染物，约5 min;

(3) 同时,打开日光灯，擦拭消毒安全柜的内表面和所有要用到的物品。

1.3.3 生物安全柜的正确操作和注意事项

(1) 双臂垂直缓慢进入安全柜前面的开口，在安全柜内静止等待一分钟；

(2) 待安全柜调整完毕后，保持身体离前窗10 cm以外，在安全柜内进行各种生物实验操作；

(3) 操作结束后，应让生物安全柜继续运行至少3 min来完成柜内空气净化过程。

(4) 在操作时为避免对气流干扰，应避免胳膊在前窗开口处快速移动和频繁进出；

(5) 废弃物应存放在生物安全柜内的容器中，待密闭消毒后再拿出安全柜；

(6) 在生物安全柜内操作时，不要进行文字工作；

(7) 操作这身后尽量不要站人，更不要来回走动；

(8) 操作完毕后，应在安全柜内对污染的手套先消毒后再脱下。

1.3.4 生物安全柜的维护

(1) 定期清洁生物安全柜：用70%医用酒精擦拭消毒安全柜的内壁和台面，保持清洁；

(2) 当生物安全柜被污染时，可用：甲醛、过氧化氢熏蒸法消毒；

(3) 每年需要检查和更换消毒用的紫外灯；

(4) 每年应更换一次HEPA过滤器，确保生物安全柜的有效性；

(5) 定期对生物安全柜进行检定，内容包括：

正面进气的气流速度，柜内顶部向下气流的速度，HEPA过滤器的完整性，人员、产品和交叉污染保护测试，柜体泄漏测试等。

2 高压灭菌器(Pressure sterilizer)

在分子生物学实验中工程菌的增殖、重组质粒的转化和细胞培养等工作，均要求所使用的试剂、器皿和实验用具严格灭菌；有害生物实验的废弃物的无害化处理；有的实验还要求无核酸酶的污染，因此实验室对实验器械、试剂等的高压灭菌是必不可少的。由于蒸汽获取方法简单、温度高、穿透力强、无污染，因此，用蒸汽真空灭菌器作为热力灭菌的主要生物安全设备，在生物医学实验室广泛使用[2]。

消毒和灭菌的概念是不一样的。消毒（disinfection）是指杀灭或消除传播媒介上的病原微生物，使其数量减少到不再能引起人发病，即达到无害化处理的目的，如煮沸、巴氏消毒、紫外线照射等。灭菌(sterilization)是指不仅要杀灭和清除传染性病原微生物，还要杀灭和清除全部微生物（如：细菌芽胞等），包括非致病性微生物，即没有活菌存在，如：高压蒸汽灭菌、环氧已烷灭菌等。

2.1 高压蒸汽灭菌器的原理

将灭菌的物品放在一个密闭的压力容器内，通过加热使水沸腾产生蒸汽（如蒸汽锅炉），将蒸汽输入压力容器内,先通过热蒸汽将容器内的冷空气排尽，再关闭阀门，继续加热。由于热蒸汽在密闭容器中体积急剧膨胀（约1700倍），容器内的压力增加(室内压力表压力＞0.1 MPa)，使容器内的温度迅速升高(沸点升高)，达到121℃以上的高温，利用蒸汽释放的潜热使微生物体内蛋白质凝固变性而达到灭菌的目的[3]。

2.2 高压灭菌器的组成和分类

压力容器的结构主要是由:壳体(本体和封头)、连接件、密封元件、接管、安全附件(安全阀和压力表)和支座组成。见下图所示：

图1 圆桶形压力容器的基本结构

目前普遍使用的高压灭菌器可分为两类：一类为下排气式高压灭菌器，具有温度高、热穿透力强、灭菌效果好优点；另一类是抽真空脉动式真空灭菌器，属于目前较先进的压力容器设备,具有排出冷空气快、灭菌时间短、对物品损坏轻、环境温度低和自动干燥等优点。

2.3 高压灭菌器的安全操作

高压灭菌器属于一类压力容器（0.1 MPa≤P设计＜1.6 MPa），是涉及生命安全、危险性较大的特种设备之一，国家早已颁布了有关的法规标准，如2003年国务院制定并实施的《特种设备安全监察条例》、2000年实施的国家质量技术监督局制定的《压力容器安全技术监察规程》等，明确规定了压力容器操作人员的职责和安全管理制度,压力容器操作人员要通过“压力容器操作人员考核”合格后方能使用压力容器，即持证上岗。

2.3.1 人员培训，持证上岗

操作人员要定期参加专门的技术培训，学习压力容器的基本知识，熟悉国家的有关安全技术法规。了解本岗位压力容器的结构、类别、工艺技术参数和主要技术性能。应在取得当地政府授权的压力容器安全监察机构颁发的《压力容器操作人员合格证》资格后，才能独立承担压力容器的操作。

2.3.2 规范操作

要严格按照“安全及工艺参数操作规程”精心操作，做好操作前各项安全检查(本体和安全附件)和操作过程中的巡回检查, 认真填写运行记录。

2.3.3 正确应对突发情况

压力容器容器运行中,如果发生异常危及安全时，应采取紧急措施,并及时上报。

2.3.4 高压灭菌器的操作例举(以卧式压力灭菌器为例)

2.3.4.1 灭菌前的准备工作

（1）检查安全附件是否齐全、完好；

（2）本体及受压元件有无裂纹、变形、泄漏等现象；

（3）各种阀门和密封元件是否完好,有无跑、冒、滴、漏和筒内积水；

（4）快开门式压力容器应做端盖与筒体法兰紧固啮合实验；

（5）在设备通蒸汽前压力表的压力应在在零位；（6）将柜室内擦拭清洁,排气管要畅通；

（7）将要准备灭菌的物品按要求放入金属蓝内，要松散放置，使蒸汽能均匀作用于装载的物品。消毒玻璃容器时，要将敞口的玻璃容器口朝下放置或平放。

2.3.4.2 灭菌操作步骤:

（1）将灭菌物品放入柜室内,关闭柜门；

（2）把蒸汽控制阀门移至“关闭”位置、截止柜室；

（3）开启进入夹管的蒸汽阀门，将夹管内冷气排走；

（4）待夹管压力表压力达到灭菌压力要求（一般为0.11MPa）时，把蒸汽阀转至“消毒”位置，蒸汽进入内，使柜室的冷气排出；

（5）待柜室压力达到要求时（一般为0.11 MPa），旋动调整阀保持定记录灭菌时间；

（6）待达到灭菌时间后，把蒸汽控制阀转至“排汽”位置，排出柜内蒸汽；

（7）确定蒸汽排净,表压为“0”,将柜门打开,取出灭菌过的物品;

（8）灭菌结束，关紧进气阀。

2.4 高压灭菌器使用的注意事项

2.4.1 严禁超温超压运行

由于压力容器允许使用的温度、压力、流量及介质充装等参数是依据工艺设计要求和保障安全生产的前提下制定的，故应在设计压力和温度范围内操作，以确保安全运行。

2.4.2 应注意平稳操作

缓慢地进行加载和卸载。操作时要做到:四慢一平稳,即慢升温慢升压慢降压慢降温,恒温操作时工艺参数要稳定。因为开始加压时，过快的加载速度会降低材料的断裂韧性，使存微小缺陷的容器在压力的冲击下发生脆性断裂。

2.4.3 严禁带压操作

不带压松紧螺栓和维修;门关到位后才能通汽升压,灭菌后一定要等蒸汽排净,表压为“0”时才能开门。

2.4.3 注意装载容量

下排气灭菌器的装载量不得超过压力容器内容量的80%,预真空灭菌器的装载量不得超过90%。且不能小于容器内容量的10～5%，以防止“小装量效应”。

2.4.4 灭菌物品尽量分类灭菌

实验前准备消毒的物品和实验后要灭菌的废弃物，应分开灭菌；容易和难于灭菌的物品也应分开高压，或以最难灭菌的物品的温度压力要求为准。

2.4.5 灭菌物品应按要求摆放

（1）消毒玻璃容器时，要将敞口的玻璃容器口朝下放置或平放;

（2）消毒有包装材料的物品时，应用自动启闭式或带气孔的器具装放，以保证物品内部空气的排出和蒸汽的进入;

（3）消毒器皿时，尽量单独包装，盖要打开，以利蒸汽渗入；

（4）难于灭菌的物品、织物包放上层，较易灭菌的物品、金属物品放下层，不要靠门和四壁摆放物品，以防吸入较多的冷凝水。

2.4.6 废弃物灭菌前的消毒：

大多数生物实验室（Ⅰ、Ⅱ级）,使用脉动真空灭菌器，灭菌前随着冷空气的排放会有没有消毒灭菌的热蒸汽排出，导致容器中内气溶胶随蒸汽向周围环境扩散。如果灭菌物品是污染过有害病原微生物，这时会在灭菌器周围会产生有害气溶胶，污染环境，威胁人的健康。故在对有害废弃物灭菌前，应对污染过的物品先进行消毒即无害化处理，如用含氯消毒液的浸泡等。

2.4.7 根据灭菌消毒物品的不同选择不同的消毒程序

消毒液体时,排出冷空气应选择“置换式”,不要用“脉动式”。

2.5 灭菌器的检定与维护

国家质量技术监督局已有明确规定：“压力容器的使用单位及其主管部门，必须及时安排压力容器的定期检验工作，并将压力容器年度检验计划报当地安全监察机构及检验单位。”[4]压力容器的定期检验包括：外部检验、内部检验和耐压试验，本文主要介绍实验室常用的几种灭菌器灭菌效果的监测方法。

2.5.1 实时监测法

指每次运行操作灭菌器时，对灭菌锅内、套层内和蒸汽输送管道内的温度、压力等指标进行实时监测，观察灭菌设备是否达到各项性能指标，并且要对灭菌各步骤的时间进行记录。这种监测方法是实验室里最经常和最容易实施的监测方法。

2.5.2 化学指示卡（管）监测方法

指将既能指示蒸汽温度，又能指示温度持续时间的化学指示卡被灭菌的物品中央，经一个灭菌周期后，取出指示卡，根据其颜色和性状的改变，判断设备是否达到灭菌效果。

2.5.3 生物监测法

指将内函式压力蒸汽灭菌监测管置于检验包的中心位置，经一个灭菌周期后，取出，挤出里边的培养基，按规定的时间进行培养，观察培养基的颜色变化。监测时应设阴性对照和阳性对照，如：嗜热脂肪芽胞菌。

2.5.4 压力容器使用单位应在规定时间内向当地技术监督部门注册登记,核定压力容器的安全状况等级。使用部门对在用容器应建立:灭菌器的检验、维修和报废等技术档案。

2.5.5 当灭菌器暂时停用时，应作好停用期间的维护工作，如：保持容器内的清洁和干燥，防止设备受到大气的腐蚀；清除容器内的物品，尤其是有腐蚀性物品。

3 超净台(Purificatory cabinet)

超净台作为目前实验室最常用的无菌操作设备广泛应用于生物医学实验室。它体积小，净化效率高，操作简便，可有效保护实验样品，适用于无毒无害样品的无菌操作。早在生物安全柜使用之前，超净台是当时实验室最有效的无菌操作设备。

3.1 超净台的工作原理

超净台由三相电动机作为鼓风动力，将超净台周围的空气从超净台的下方的两侧面或背面鼓入，经过上部金属网内的“超级滤清器”过滤，形成连续不断的无尘无菌的洁净空气层流，即“高效的无菌空气”，它已经滤去了0.3μm以上的尘埃颗粒、真菌和细菌孢子等大部分微生物。洁净的气流从超净台上部送入下边的操作台面上，经正面出口处排出。空气流出速度为：30m/ min,足以阻止外部的空气直接流入超净台。

3.2 超净台的使用注意事项

3.2.1 超净台操作简便，准备时间短，打开开关运行10 min就可以进行操作，使用方便。

3.2.2 要在超净台内进行接种操作时，超净台内应保持清洁，凡与接种无关的物品不要放入，以保持无菌状态。超净台周围的空气也应保持新鲜和清洁，可在通气窗上覆上4层纱布以简单滤尘。

3.2.3 任何时候不应将超净台的进风孔对着开启的门或窗户，以免影响滤清器的过滤效果。

3.2.4 除每次使用前应用紫外灯照射超净台的无菌室外，还应定期用70%的医用酒精或2%新洁尔灭擦拭消毒台面。

4 通风橱(Ventilator)

通风橱也是实验室常用的生物安全设备，可有效将橱内的有毒有害的挥发性试剂排到室外，保护操作者和实验室环境。

4.1 通风橱的工作原理

通风橱的设计原理很像一级生物安全柜，所不同的是没有HEPA过滤器。通过位于通风橱上部的一电动式鼓风机将橱内的空气抽走，即外部空气从通风橱正面进入橱内，随橱内气体一同上排到管道中。

4.2 通风橱的正确使用

4.2.1 通风橱虽然能将大部分有害气体排走，但由于不是密封式操作，还是会有少量有害气体泄漏，建议在通风橱前操作时戴上口罩、护目等。

4.2.2 如用通风橱操作腐蚀性试剂时，应选择用耐腐蚀材料制成的通风橱设备，定期用清水擦拭橱内墙壁，保持橱内清洁。

以上讨论了实验室常用的几种生物安全设备，尽管它们在生物安全防护方面起到了一定的作用，但它们也只是降低操作的风险，生物安全最重要的是实验者自身的防护意识和规范的生物操作，仅仅靠生物安全设备的作用是不够的。

[1]周维华.生安全柜医药行业标准[S]. YY0569-2005.

[2]雷东锋. 现代生物化学与分子生物学仪器与设备[M].科学出版社，2006.

[3]石智豪.压力容器安全操作技术[J].中国锅炉压力容器安全杂志，1989.

[4]国家质量技术监督局.压力容器安全技术监察规程[J].中国锅炉压力容器安全杂志，2000.

Manipulation and maintenance of biological safety equipment in laboratory

Zhang Yanwan, Ye Jue, Shi Na, et al

In order to perform the state rule of biosafety and promote the managing level, this paper have discussed the several biological safety equipments such as biological safety cabinet, pressure sterilizer, purificatory cabinet and ventilator in medical laboratory (BSL-2) etc. The working principle, operating standard and maintenance of the equipments were elaborated respectively. The importance and significance on securing operation and standard management of biological safety equipment have been emphasized. This paper introduced and showed the author’s working experience and realization in combination with routine work.

Laboratory; Biosafety; Equipment; Manipulation; Maintenace

1672-8270(2010)01-0015-06

TH 772

B

张燕婉,女,(1957- ),北京大学毕业，生物化学专业，大学本科，理学学士。现就职于阜外心血管病医院中心实验室，主任技师，主要从事仪器分析、生化分析和实验室管理工作。

2009-11-14

①中国医学科学院阜外心血管病医院中心实验室 北京 100037

China Medical Equipment, 2010, 7(1):15-20.

[First-author's address]Central Laboratory, Fuwai Hospital of Cardiovascular Diseases, Chinese Academy of Medical Sciences, Beijing 100037, China.

近年来，我国为加强实验室生物安全管理，减少医学实验室生物安全事件和感染事故的发生，政府颁布了各种有关实验室生物安全的国家标准：GB19781-2005《医学实验室 安全要求》、GB19489-2008《实验室 生物安全通用要求》、国务院令第424号《病原微生物实验室生物安全管理条例》,使政府和广大科研工作人员对实验室中产生的生物危害有了更为深刻的认识，明确了使用生物安全防护设备（安全隔离装置）是实验室生物安全防护的有效措施，是保护实验室工作人员和环境的重要手段。下表列举了医学生物实验室经常从事的实验活动中可能发生的危害和应该使用的生物安全防护设备：见表1。