被动吸烟下调大鼠卵巢雌、孕激素及其受体的表达

尹崇高，李若葆，李洪利，杨晓

(1.山东省潍坊医学院护理学院，潍坊 261053;2.潍坊医学院人体解剖学教研室，潍坊 261053; 3.潍坊医学院医学研究实验中心，潍坊 261053)

研究报告

被动吸烟下调大鼠卵巢雌、孕激素及其受体的表达

尹崇高1，李若葆2，李洪利3，杨晓1

(1.山东省潍坊医学院护理学院，潍坊 261053;2.潍坊医学院人体解剖学教研室，潍坊 261053; 3.潍坊医学院医学研究实验中心，潍坊 261053)

目的利用W istar大鼠烟雾吸入模型，观察被动吸烟对W istar大鼠卵巢结构的影响，检测生殖激素水平，分析生殖内分泌的变化，为提倡生育期妇女避免被动吸烟提供新的理论依据。方法建立大鼠烟雾吸入模型。32只健康雌性W istar大鼠，鼠龄(60±5)d，每只体重200～250 g，随机分为空白对照组和实验组，每组16只。实验组吸烟3个月，对照组正常饲养。3个月后处死两组大鼠。酶联免疫吸附试验方法(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)检测雌鼠血清中雌激素(estrogen，E2)、孕激素(progesterone，P4)的水平;常规石蜡切片，免疫组织化学SP法检测各组雌鼠卵巢雌激素受体(estrogen receptor，ER)、孕激素受体(progesterone receptor，PR)的表达情况。所得数据采用SPSS软件作统计学处理分析，比较各组间差异程度。结果①酶联免疫吸附试验结果:吸烟3个月大鼠血清E2水平比空白对照组显著降低，其浓度值比较差异有显著性;吸烟3个月大鼠血清P4水平比空白对照组显著降低，其浓度值比较差异有显著性。②免疫组织化学结果:ER主要表达在大鼠卵巢组织的各级生长卵泡的颗粒细胞的细胞核内，呈棕黄色颗粒状分布，卵泡膜细胞和间质细胞也有少量表达。吸烟3个月的大鼠卵巢组织中ER的表达显著低于空白对照组。PR主要表达在大鼠卵巢组织卵泡的颗粒细胞的细胞质和细胞核中，呈棕黄色颗粒状分布，吸烟3个月的大鼠卵巢组织中PR的表达显著低于空白对照组。结论①成功的建立了大鼠被动吸烟模型。②被动吸烟可使大鼠血清中E2及P4水平明显降低，使大鼠卵巢中ER及PR的表达减少，提示被动吸烟可破坏卵巢的功能，引起生殖内分泌失调。

被动吸烟;卵巢;雌激素;孕激素;雌激素受体;孕激素受体

近年来，被动吸烟对非吸烟妇女生殖健康的危害，引起越来越多的国内外学者重视。他们认为环境烟草烟气中有很多有害物质如苯、铅、锰、多环芳烃等可对女性生殖系统产生损害作用。这些损害表现为:①循环雌激素、孕激素减少。②对卵泡发育的影响。Bordel等［1］研究发现，尼古丁能通过诱导细胞的凋亡而抑制卵泡的发育。尼古丁、镉和多环芳烃类物质可使卵泡成熟率降低，成熟的卵母细胞数目减少，造成妇女生殖能力下降，卵子储备量下降［2］。卵泡刺激素升高是卵子储备量低下的表现。Cooper等［3］对290名妇女检测发现，吸烟妇女的卵泡刺激素比被动吸烟妇女高39%，较不吸烟者高60%。透明带围绕在卵母细胞周围，在卵母细胞受精前后、胚胎孵化及种植过程中起着重要的作用。受精后胚胎的透明带变硬，然后逐渐变薄，透明带变薄易于胚胎孵出。以往的研究仅限于流行病学分析和体外实验对女性的生殖系统的影响，但模拟年轻女性被动吸烟，研究被动吸烟对卵巢内分泌功能的影响尚无报道。

本实验通过建立大鼠被动吸烟模型，酶联免疫法检测血清雌激素、孕激素的水平，免疫组织化学技术检测雌激素受体、孕激素受体在卵巢组织中的表达，并与未吸烟对照组进行比较，探讨被动吸烟对卵巢生殖内分泌功能的影响，为提倡生育期妇女避免被动吸烟提供新的理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物及分组

实验动物采用健康、性成熟、未交配过的雌性SPF级W istar大鼠，鼠龄(60±5)d，体质量200～250 g，来源于山东大学实验动物中心［SCXK(鲁) 2003－0004］，实验期间提供足量的自来水及山东大学动物实验中心提供的普通饲料，动物室温度保持在22℃左右，自动通风，光照周期8:00－18:00，适应3 d后用于实验。并按实验动物使用的3R原则给予人道的关怀。

1.2 实验主要试剂

大鼠E2、P4ELISA检测试剂盒购自美国ADL公司;兔抗大鼠ER、PR多克隆抗体购自Santa－Cruz公司;SP免疫组化试剂盒购自北京中杉金桥生物技术有限公司。

1.3 实验方法

1.3.1 动物模型的制备与分组:健康性成熟未交配过的雌性SPF级W istar大鼠32只，鼠龄(60±5)d，体质量200～250 g，随机分为2组，即吸烟组和正常对照组，每组16只，正常对照组在正常呼吸空气条件下饲养，吸烟组给予烟雾吸入。将每组大鼠分笼喂养，给基础饲料，注意给充足的水。参照徐凌等［4］大鼠烟雾吸入模型，利用有机玻璃、钢架、小型风扇等自制大鼠被动吸烟烟箱，规格:91cm×59 cm×62 cm。每天将烟雾吸入组大鼠置于烟箱内，每次燃烧10支芙蓉香烟(湖南中烟工业公司生产，84 mm过滤嘴香烟，烤烟型，焦油量12 mg，烟气烟碱量1.1 mg，烟气一氧化碳量14 mg)，每支燃烧约12 min，停5～6 min，共约3 h，每天2次，每周5d，连续3个月。3个月后在动情前期处死吸烟动物和相应的对照动物，取卵巢组织标本进行免疫组织化学染色，取血清进行ELISA。

1.3.2 ELISA:完全按大鼠E2、P4ELISA试剂盒操作步骤进行。最后在450 nm波长处测定各孔的A值，利用标准曲线得出相应的浓度值。

1.3.3 免疫组化:完全按照SP免疫组化试剂盒操作说明进行。结果分析:采用医学图像分析软件进行分析。将每张切片待测细胞在显微镜下定位后，在图像监视器上显示图像，测定该区域细胞的积分光密度(integral optical density，I A)、面积(area)的值，再随机观察10个视野(×200)，分别取每张切片的平均值作为该组的所测激素受体的含量值，最后以整个一组的均值作为该受体在卵巢组织表达的相对强度。

1.4 统计学分析

2 结果

2.1 ELISA检测血清中激素水平

2.1.1 大鼠血清E2水平:吸烟组大鼠血清E2水平比空白对照组显著降低，其浓度值比较差异有统计学意义(P＜0.05，见表1)，提示被动吸烟对大鼠血清中E2水平有影响。

2.1.2 大鼠血清P4水平:吸烟组大鼠血清P4水平比空白对照组显著降低，其浓度值比较差异有统计学意义(P＜0.05，见表1)，提示被动吸烟对大鼠血清中P4水平有影响。

表1 吸烟组与对照组大鼠血清E2、P4水平(±s，n=16)Tab.1 The serum levels of E2and P4in the smoking and control rats(±s，n=16)

表1 吸烟组与对照组大鼠血清E2、P4水平(±s，n=16)Tab.1 The serum levels of E2and P4in the smoking and control rats(±s，n=16)

组别(Group) E2 P4 A值(A value)浓度(ng/m L)Concentration A值(A value)浓度(nmol/L)Concentration空白对照组(Control)1.76±1.06 35.74±30.30 1.45±0.44 68.96±26.30吸烟组(Smoking)0.95±1.10 21.02±18.65 0.92±0.69 39.98±21.36

2.2 免疫组织化学检测卵巢ER及PR蛋白表达

ER主要表达在大鼠卵巢组织的各级生长卵泡的颗粒细胞的细胞核内，呈棕黄色颗粒状分布，卵泡膜细胞和间质细胞也有少量表达(见图1、2)。吸烟三个月的大鼠卵巢组织中ER的表达显著低于空白对照组(P＜0.01，见表2);PR主要表达在大鼠卵巢组织卵泡的颗粒细胞的细胞质和细胞核中(见图3、4)，呈棕黄色颗粒状分布，吸烟三个月的大鼠卵巢组织中PR的表达显著低于空白对照组(P＜0.01，见表2)。(图1～4见彩插6。)

表2 吸烟组与对照组大鼠卵巢ER、PR的表达情况(±s，n=16)Tab.2 The expression of ER and PR in smoking and control rats(±s，n=16)

表2 吸烟组与对照组大鼠卵巢ER、PR的表达情况(±s，n=16)Tab.2 The expression of ER and PR in smoking and control rats(±s，n=16)

组别(Group)ER PR面积(Area)积分光密度(I A)面积(Area)积分光密度(I A)空白对照组(Control)214.85±30.47 337346.74±4694.30 516.28±316.98 90992.50±50062.66吸烟组(Smoking)165.92±33.25 29164.62±6038.65 173.04±92.1530085.75±13156.50

3 讨论

世界卫生组织(World Health Organization，WHO)定义被动吸烟为不吸烟者，在一周中有一天以上吸入吸烟者呼出的烟雾超过15min/d。近年来，被动吸烟对非吸烟妇女生殖健康的危害，引起越来越多的国内外学者重视。他们认为环境烟草烟气中有很多有害物质如苯、铅、锰、多环芳烃等可对女性生殖系统产生损害作用。

卵巢能够合成大量的甾体激素，主要是雌激素和孕激素。在哺乳动物，E2、P4是主要由女性/雌性性腺卵巢直接分泌的性激素，因此卵巢的功能状态对于女性/雌性生殖组织的生长、分化以及生育功能和月经周期/动情周期的维持具有十分重要的作用。雌激素对卵巢本身的发育是必需的，卵巢生发上皮的功能以及在皮质各期卵泡的成长和发育均需要雌激素的存在，颗粒细胞和卵泡膜细胞既是分泌产生雌激素的部位，其本身也有ER，并接受雌激素的影响。排卵前卵泡液中含有一定浓度的P4，研究者推测，卵泡成熟的信号转导可能需要特殊的卵泡内孕酮环境，通过特异性地与细胞核受体结合而产生作用［5］。

在成年人和哺乳动物中，E2调节卵巢功能。ER受体2种亚型均表达在卵巢中。ERβ在颗粒细胞间质及生发上皮的核内呈阳性表达，ERα在间质生发上皮的核内呈阳性表达，在颗粒细胞中呈阴性反应。表明在卵巢生理功能调节中ERβ发挥更主要作用［6］。如果ER在卵泡内不足，卵泡的发育、生长、成熟、激素产生和排卵一系列生理活动将会受限。它们不仅影响女性性征的发育、妊娠及行为，也在卵巢内部产生重要影响［7］。Chen等［8］对新近结婚欲妊娠的371名不吸烟的健康妇女进行了前瞻性调查，分析344个未孕周期和329个怀孕周期两者晨尿中雌酮结合物(estrone conjugates，E1C;雌激素的主要代谢产物)孕二醇－3－葡糖苷酸(pregnanediol－3－glucuronide，PdG;孕激素的主要代谢产物)的水平。Flouris等［9］研究发现暴露于二手烟的妇女，17β－雌二醇和孕激素水平明显降低，LH和FSH水平降低。为了评估ETS对卵巢功能的直接影响，Vidal等［10］将原代培养的黄体颗粒细胞暴露于ETS。ETS低浓度和高浓度都使雌激素的产生明显降低。在一个相似的模拟系统，新烟碱和尼古丁竞争性抑制芳香化酶，而芳香化酶是雄激素转化为雌激素的必需酶。此外，高浓度ETS可以引起孕激素生成降低。游离尼古丁和尼古丁酒石酸氢盐可以降低人类黄体颗粒细胞分泌孕激素。

本实验用ELISA检测被动吸烟大鼠与空白对照组大鼠血清中雌激素水平的改变，结果显示被动吸烟组大鼠血清雌激素均比空白对照组明显降低;用免疫组化方法检测被动吸烟大鼠与空白对照组大鼠卵巢中ER的表达，结果显示被动吸烟组大鼠ER的表达显著低于空白对照组，提示被动吸烟可引起血清中E2含量的减少，也可引起卵巢ER的表达减少。

Gava等［11］用免疫组化检测小鼠卵巢孕激素受体各亚型的表达，对于排卵卵泡的卵泡膜和颗粒细胞，窦前卵泡，窦状卵泡和黄体的卵泡膜细胞上都表达PRA、PRB，而窦前卵泡、窦状卵泡和黄体的颗粒细胞上仅表达PRB。王育华等［12］研究表明，卵巢中大量表达PRA、PRB。对PR蛋白敲除(PRKO)研究表明，PRKO小鼠不能排卵，但小鼠的卵泡是成熟卵泡，并有成熟的卵母细胞和完整的功能，能在体外受精，且排卵前的颗粒细胞能分化成黄体并能表达黄体的标记物P450侧链裂解酶［13］。因此PR是黄体生成激素(LH)依赖排卵所必需，而非颗粒细胞化成黄体所必备。ADAMTS－l是孕激素诱导排卵的关键调节剂，用超排卵剂量的GnRH刺激PRAKO、PRBKO、PRKO的小鼠，与野生型的小鼠比，PRAKO小鼠的超排卵严重受损，但被孕激素诱导的ADAMTS－1和组织蛋白酶L(cathepsin－L)并未受损;PRBKO小鼠的促超排卵无影响;PRKO小鼠的促超排卵和孕激素诱导的成熟卵泡的壁层颗粒细胞上的ADAMTS－l和cathepsin－L被完全抑制［14］。这说明PRA的表达是排卵所必需的，PRB可能调节卵泡破裂的信号传导通路，但这种机制尚未完全阐明。PRA/PRB与LH对排卵前的卵泡颗粒细胞的ADAMTS－l基因的反式激活起到协同作用，成为该基因诱导性的辅助调节子。对猪的卵丘－卵复合物(COCs)的研究表明，用FSH和LH作用于COCs，8h后卵丘上的PRB达高峰，20 h后PRA达高峰，PRA、PRB时空变化可影响卵丘细胞的增大和卵母细胞重新启动第二次减数分裂［15］。张鸿波等［16］研究发现PR不仅受P4的调节，而且受E2的调节。

本实验用ELISA检测被动吸烟大鼠与空白对照组大鼠血清中孕激素水平的改变，结果显示被动吸烟组大鼠血清孕激素均比空白对照组明显降低;用免疫组化方法检测被动吸烟大鼠与空白对照组大鼠卵巢中PR的表达，结果显示被动吸烟组大鼠PR的表达显著低于空白对照组，提示被动吸烟可引起血清中P4含量的减少，也可引起卵巢PR的表达减少。

(本文图1～4见彩插6。)

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Effects of Passive Sm oking on Rat Ovarian Estrogen and Progesterone and Their Recep tors

YIN Chong－gao1，LI Ruo－bao2，LI Hong－li3，YANG Xiao1
(1.School of Nursing，2.Department of Anatomy，3.Medical Experiment Center，Weifang Medical College，Weifang 261053，China)

ObjectiveThe aim of this study was to observe the effects of passive smoking on ovarian structure in Wistar rats and detect reproductive hormone levels to analyze the changes in reproductive endocrinology，and provide further theoretical and experimental evidence for promoting reproductive age women to avoid passive smoking.M ethods Thirty two healthy female W istar rats，200－250 g weight，were random ly divided into control and smoking groups(n=16).The control rats fed normally and the experimental rats smoked for 3 months.All rats were killed at 3 months after the experiment.The serum E2and P4levels were measured by enzyme linked immunosorbent assay(ELISA).The expressions of ER and PR were assessed by immunohistochemistry.The data were analyzed with SPSS 11.5 for W indows.Results①The ELISA showed that the serum levels of both estrogen and progesterone were significantly lower in the smoking rats than those in non－smoking rats(both P＜0.05).②Immunohistochemical results showed that ER positive material was mainly distributed in the cell nuclei of the rat ovarian granulosa cells.The ER expression level was significantly lower in theovaries of smoking rats than that in the control group(P＜0.01).PR positive material mainly was distributed in the cytoplasm and cell nucleus of the rat ovarian granulosa cells.The level of PR expression was significantly lower in the ovaries of smoking rats than that in the control group(P＜0.01).Conlusion①A rat model of passive smoking has been successfully established.②Passive smoking can decrease the serum levels of E2and P4in rats and the expression of ER and PR in rat ovaries.Passive smoking can harm ovarian function and cause reproductive endocrine disorders.

Passive smoking;Ovary;Estrogen;Progesterone;ER;PR;Rats

Q954.62

A

1005－4847(2010)04－0331－05

2009－11－29

山东省卫生厅资助项目(编号:2007HZ021)

尹崇高(1979－)，男，讲师，主要从事临床外科。

李若葆，潍坊医学院解剖学教研室，副教授，硕士生导师，E－mail:lirb@w fmc.edu.cn