噬菌蛭弧菌代谢产物活性成分对小鼠免疫功能的影响

白 冰,王高学,师长宏,张 海

(1.第四军医大学实验动物中心,西安 710032;2.西北农林科技大学动物科技学院,陕西杨凌 712100)

研究报告

噬菌蛭弧菌代谢产物活性成分对小鼠免疫功能的影响

白 冰1,王高学2,师长宏1,张 海1

(1.第四军医大学实验动物中心,西安 710032;2.西北农林科技大学动物科技学院,陕西杨凌 712100)

目的研究噬菌蛭弧菌代谢产物活性成分对小鼠免疫功能的影响。方法将噬菌蛭弧菌代谢产物的 3种有机溶剂 (石油醚、三氯甲烷、乙酸乙酯)提取物和提取后的剩余液体分别腹腔注射实验小鼠,分两次注射,共注射 0.5 mL,注射后连续饲养 28 d,每隔 7 d小鼠采血检测离体白细胞吞噬活性 (phagocytic activity)、吞噬细胞杀菌活性 (bactericidal activity)、超氧化物歧化酶 (superoxide dismutase,SOD)活性、血清凝集抗体效价、血红蛋白值和红细胞数的变化,以研究不同提取物对小鼠免疫功能的影响。结果石油醚提取物组和三氯甲烷提取物组小鼠血清 SOD活性、血清凝集抗体效价、离体白细胞吞噬活性和吞噬细胞杀菌活性增强与对照组相比差异极显著 (P< 0.01);乙酸乙酯提取物组 SOD活性和血清凝集抗体效价增强与对照组相比差异极显著(P<0.01),离体白细胞吞噬活性和吞噬细胞杀菌活性增强与对照组相比差异显著 (P<0.05);石油醚提取物组的血红蛋白值 (12.64 g/ 100 mL)和红细胞数(11.32×106/mL)最高。各项指标的峰值均出现在第 7天～第 21天。结论噬菌蛭弧菌代谢产物 3种有机溶剂提取的活性物质具有增强小鼠免疫功能的作用。

噬菌蛭弧菌;代谢产物;活性物质;免疫功能;小鼠

近年来生物活性物质作为饲料添加剂能增强动物机体免疫功能已得到证实,研究发现,微生物代谢及发酵产物比活菌制剂效果更好,是未来畜牧业养殖领域的研究热点。噬菌蛭弧菌 (B dellovibro bacteriovorus)是一类专门以捕食细菌为生的寄生性细菌,广泛存在于自然界中[1]。从上世纪 60年代由美国科学家 Stolp和 Starr发现以来,研究表明它在动物养殖上具有防病、治病、保健、促生长等多种功能。已有的报道中,噬菌蛭弧菌及其代谢产物具有增强鲫鱼免疫功能的作用[2]。作者以此为基础对噬菌蛭弧菌代谢产物进行研究,采用大孔树脂吸附和有机溶剂分离方法,分离活性物质并研究其对小鼠免疫功能的影响,为活性物质定位和以后分离单体物质提供依据。

1 材料和方法

1.1 菌株及试剂

噬菌蛭弧菌由本实验室提供;SPF级昆明小鼠购于第四军医大学实验动物中心,合格证号 SYXK (军)2007-020,平均体重 (19.1±0.5)g;大肠杆菌(E.coli)和人源型金黄色葡萄球菌 (Staphylococcus aureus)均由本实验室保存;MEM培养基、噻唑兰(MTT)和 SOD试剂盒购于南京建成生物研究所;淋巴细胞分离液 (Ficoll-Hypaque)由上海华精高科技有限公司生产;LSA-10大孔吸附树脂由西安蓝晓科技有限公司生产;TU-1810紫外分光光度计:北京普析通用仪器有限责任公司;Centrifuge 5810R低温高速离心机:Eppendorf公司。

1.2 菌悬液的制备

将试验中使用的大肠杆菌、人源型金黄色葡萄球菌分别接种普通肉汤培养,平板计数法计数后用生理盐水稀释至 1×108CFU/mL。取 10 mL人源型金黄色葡萄球菌稀释液,加入 10%甲醛液灭活 24 h,4℃保存备用。

1.3 发酵产物活性部位的追踪分离

将噬菌蛭弧菌接种于 5000 mL普通肉汤,于35℃恒温水浴摇床培养 7 d,将发酵液于 4℃6000 r/min离心 10 min,收集上清液,重复离心1次,取上清液备用。

通过预试验,选择LSA-10大孔吸附树脂对上述上清液进行活性成分的吸附,并将其装填入层析柱中,调整至一定的流速。待水液流完后,用甲醇溶液洗柱,收集甲醇,蒸馏回收甲醇,反复几次用甲醇洗柱,收集合并各馏分并低温减压浓缩,分别采用石油醚、三氯甲烷、乙酸乙酯,按极性由低到高进行提取,经浓缩、低温干燥,将所得的 4种提取物用食用油分别按 5 mL/mL定容。

1.4 发酵产物活性部位的追踪测定

1.4.1 实验动物分组 :将昆明系小白鼠随机分为 5组(提取完后剩余液组、乙酸乙酯提取物组、三氯甲烷提取物组、石油醚提取物组和对照组),每组 12只,相同条件饲养管理。将上述4中提取物分别给小白鼠进行腹腔注射,首次注射 0.3 mL,2 d后分别再注射 1次,剂量为 0.2 mL。对照组以相同方法注射同等剂量的食用油。每隔 7 d采血 1次,测定其免疫指标。

1.4.2 血红蛋白值和红细胞数的测定 :血红蛋白测定采用沙利氏比色法。红细胞计数采用试管稀释法,用沙利氏吸血管取 10μL全血样品吹入含 2 mL红细胞稀释液的试管底部,吸吹数次混匀,用血细胞计数板在显微镜下计数。

1.4.3 SOD活性的测定: 参照 SOD试剂盒说明进行,用紫外分光光度计测定 SOD活性。

1.4.4 血清凝集抗体效价的测定: 取 0.4 mL小鼠血液置于离心管中,2 000 r/min离心 6 min分离血清,以灭活的人源型金黄色葡萄球菌为反应抗原,采用血凝板法进行血清凝集抗体效价的测定。

1.4.5 白细胞悬液的制备:采用摘眼球采血法,取0.5 mL肝素钠抗凝血样置于含 0.8 mL淋巴细胞分离液的离心管中,按照李凡[3]的方法,以 2 500 r/ min离心 15 min,吸取白细胞层,用 Hank’s液调整细胞浓度为 1×107个 /mL,并按照司徒镇强[4]的方法检测白细胞活性率,活细胞不少于 90%。

1.4.6 白细胞吞噬活性的测定:取制备的 100μL白细胞悬液,参照文献[5]方法用大肠杆菌进行白细胞吞噬活性的测定。

1.4.7 吞噬细胞杀菌活性的测定:取400μL白细胞悬液(细胞数为1×106个)参照文献[5]方法用大肠杆菌(细菌个数为 1×105个)进行杀菌活性的测定。

1.4.8 统计方法:利用 SPSS13.0统计软件用方差分析及 p检验方法对数据进行处理。

2 结果

2.1 血红蛋白值和红细胞数

小鼠腹腔注射不同提取物后,其血红蛋白值有不同程度的变化。石油醚提取物组和剩余液组在第 21天时达最大值,分别为 (12.64±0.08)g/100 mL和(12.11±0.04)g/100 mL,对照组在第 14天、乙酸乙酯组和三氯甲烷组在第 21天达最大值,分别为 11.25±0.02、11.33±0.12和 11.51±0.07,而在第 28天后,所有试验组血红蛋白值均趋于正常水平(表 1)。小鼠腹腔注射不同提取物后,红细胞数在一定的时间内有明显的增加,一般在第 14～21天出现峰值,最大值为石油醚提取物组第 14天 (11.32 ×106/mL),见表 2。

2.2 SOD活性

石油醚提取物组在第 7、14、21天的 SOD活性与对照组相比差异极显著 (P<0.01),第 14天达峰值(118.36±0.26)U/mL,乙酸乙酯提取物组在第 14天达峰值(95.78±0.23)U/mL,与对照组相比差异极显著 (P<0.01),三氯甲烷提取物组在

第 7天达峰值(86.23±0.31)U/mL,剩余液组与对照组相比差异不显著,第 28天后各组差异不显著,见表 3。

2.3 血清凝集抗体效价

乙酸乙酯提取物组在注射后第 21天血清凝集抗体效价达峰值为 1:64,三氯甲烷提取物组和石油醚提取物组在第 14天达峰值为 1:128,并随着时间推移抗体水平呈平稳下降的趋势,而剩余液组与对照组相比无显著性差异,见表 4。

表 1 不同提取物注射小鼠后的血红蛋白值Tab.1 Hemoglobin(Hb)values of the mice injected with the different extractions

表 2 不同提取物注射小鼠后的红细胞数Tab.2 Erythrocyte(RBC)amounts of the mice injected with the different extractions

表 3 不同提取物注射小鼠后的 SOD活性Tab.3 SOD activities of the mice injected with the different extractions

小鼠血清离体白细胞吞噬活性以 A570nm值表示,数值越大表示活性越大。

乙酸乙酯提取物组最大值出现在第 14天,为0.258±0.023,与对照组比较差异显著(P<0.05),而三氯甲烷提取物组最大值出现在第 21 d,为0.252±0.017与对照组比较差异显著 (P<0.05),石油醚提取物组与对照组比较在第 14 d出现最大值 0.275±0.030且与对照组比较差异极显著 (P< 0.01),剩余液组无明显变化,见表 5。

2.5 吞噬细胞杀菌活性

小鼠吞噬细胞杀菌活性以 A570nm值表示,数值越小表示活性越大。乙酸乙酯提取物组和三氯甲烷提取物组在第 21天出现峰值为 0.837±0.017(P <0.05)和 0.691±0.022(P<0.01),石油醚提取物组在第 7～21天与对照组比较均有极显著性差异,峰值为 0.578±0.018(P<0.01),剩余液组与对照组相比差异无显著性,见表 6。

3 讨论

表 4 不同提取物注射小鼠后的血清凝集抗体效价Tab.4 Agglutinating antibody titers of the mice injected with the different extractions

表 5 不同提取物注射小鼠后的离体白细胞吞噬活性变化Tab.5 Changes of phagocytic activity of leucocytes of the mice injected with the different extractions

表 6 不同提取物注射小鼠后的吞噬细胞杀菌活性变化Tab.6 Changes of bactericidal activity of phagocytes of the mice injected with the different extractions

细菌代谢产物作为饲料添加剂用于动物养殖,具有低毒、低残留的特点,并且微生物本事作为机体内的有益菌群能有效地改善动物体的微生态环境和免疫功能,目前已得到认可并得到广泛应用。噬菌蛭弧菌虽然在 1961年就由李明典首次在国内介绍,但从 1997年后关于它的研究相对较少。近年来,王高学等[6]将噬菌蛭弧菌代谢产物进行粗分后饲养鲫鱼,发现对鲫鱼有一定免疫增强功能。还有报道用噬菌蛭弧菌对致病菌攻击小鼠保护性试验中揭示噬菌蛭弧菌对防制病菌攻击,减少死亡率与空白对照组比较有明显差异 (P<0.05)[7]。研究已证明[8,9],红细胞是机体免疫系统的重要组成部分,其不仅具有运输氧气和二氧化碳的功能,而且具有识别黏附杀伤抗原,清除免疫复合物和参与机体免疫调控的作用。SOD活性与生物体的免疫水平密切相关,对增强巨噬细胞的防御能力和整个机体的免疫功能有重要作用,可用来评判免疫调节剂对机体非特异免疫力的影响。血清凝集抗体效价则从整体上反映机体体液免疫的水平,而白细胞吞噬活性和吞噬细胞杀菌活性则反映机体细胞免疫的水平。因此,上述指标能初步反映噬菌蛭弧菌不同提取物对小鼠免疫功能的影响。

本试验将噬菌蛭弧菌代谢产物用大孔吸附树脂分离活性物质,并作用于哺乳动物进行研究,试验结果表明,从代谢产物中提取的活性物质对增强小鼠免疫功能具有一定的作用。活性物质主要集中在石油醚提取物中,说明活性物质极性与石油醚相似,为以后分离单体成分和化学合成提供了依据。试验中血红蛋白值、红细胞数和血清凝集抗体效价改变不是非常明显,但都有所提高,说明活性物质具有增强动物机体免疫功能的作用。提高不明显这可能与注射提取物剂量小有一定关系。SOD活性、吞噬活性和杀菌活性增强与对照组相比差异明显,说明活性物质对提高小鼠非特异性免疫水平和细胞免疫水平有较为明显的作用。然而,腹腔注射小鼠后,机体免疫功能虽能在短时间内得到提高,但维持时间较短,到 28 d后实验组和对照组差别不明显。作者认为,要想长时间维持增强作用,需要持续对动物给药,计量可以不用很大,长期低剂量的免疫刺激也许能长时间使动物保持较高免疫水平。另一方面,本实验并未对活性物质的毒性进行检测,无法预测长期给药后是否对机体有毒性作用,这可以作为以后研究的一个方向,为以后研究低毒或无毒产品提供数据。本实验的意义在于,为今后活性物质定位,分离单体物质和化学合成提供了重要依据,降低滥用抗生素的风险,减少有害物质在动物体内的残留,最终为生产绿色无公害农产品提供依据。

[1] 张丽花,马宗敏,关杉杉,等 .噬菌蛭弧菌的研究进展[J].医学动物防制,2008,24(3):161-164.

[2] 王高学,白冰.9种细菌成分及其代谢产物对鲫鱼免疫功能的影响[J].西北农林科技大学学报 (自然科学版),2006,34 (2):39-44.

[3] 李凡,刘晶晶.医学微生物学[M].北京:人民卫生出版社, 2008:105-106.

[4] 司徒镇强,吴军正.细胞培养[M].西安:世界图书出版公司, 2007:90-91.

[5] 王高学,徐翔,李素霞.α-甘露聚糖肽对鲫鱼免疫应答强度的影响研究 [J].西北农林科技大学学报 (自然科学版), 2005,10(3):21-25.

[6] 王高学,崔婧,等.4株细菌代谢产物增强鲫鱼免疫功能有效活性部位的研究[J].淡水渔业,2007,37(1):3-8.

[7] 冯晓英,张海鹰.噬菌蛭弧菌对致病性大肠杆菌感染小鼠保护性作用的研究[J].中国微生态学杂志,1999,11(5):269 -271.

[8] 翟瑄,夏佐中.红细胞免疫功能研究进展 [J].重庆医学, 2008,37(20)2365-2367.

[9] 马宏伟,郑世民,赵良有,等.红细胞免疫研究进展[J].中国兽医杂志,2009,45(4)79-80.

Enhancing Effect of Active Components from Bdellovibrio bacteriovorus M etabolites on I mmune Function in M ice

BA IBing1,WANG Gao-xue2,SH IChang-hong1,ZHANG Hai1
(1.LaboratoryAnimal Center,FourthMilitaryMedicalUniversity,Xi’an 710032,China; 2.College ofAnimal Science and Technology,NorthwestAgriculture and ForestryUniversity,Yangling,Shaanxi 712100,China)

ObjectiveTo study the effect of active components from Bdellovibrio bacteriovorus metabolites on immune functions in mice。MethodsTo inject the mice with ethyl acetate extraction(EAE),chloroform extraction (CE),petroleum ether extraction(PEE)and residual liquid(RL)ofBdellovibrio bacteriovorusmetabolites,respectively. The changes of immune functions in the mice were investigated by detection of Hb value,RBC amount,SOD activity, agglutinating antibody titer,phagocytic activity and bactericidal activity every 7 day. Each mouse was injected with extraction 0.5mL twice。ResultsCompared with the mice injected with edible oil in the control group,the mice in CE and PEE groups were very significantly different(P <0.01)in SOD activity,agglutinating antibody titer,phagocytic activity and bactericidal activity.The EAE group had very significantly difference(P <0.01)in SOD activity and agglutinating antibody titer.The EAE group had significantly enhanced phagocytic and bactericidal activities(P<0.05). The maximum of Hb value(12.64 g/100 mL)and the max imum of RBC amount(11.32×106/mL)were found in the PEE group and the climax of every index reached on day 7 to 21 post-injection。Conclusions The active components of Bdellovibrio bacteriovorus could enhance the immune function ofmice.

Bdellovibrio bacteriovorus;Metabolite;Active component; Immune function;Mouse

R-33

A

1671-7856(2010)02-0025-05

2009-08-26

白冰(1980-),男,兽医师,研究方向:实验动物免疫学研究。