益肾解毒通络汤对糖尿病大鼠肿瘤坏死因子-α的影响

金英花，南 征

(1.广东药学院附属第一医院，广东广州 510080；2.长春中医药大学第一附属医院，吉林长春 130021)

益肾解毒通络汤对糖尿病大鼠肿瘤坏死因子-α的影响

金英花1，南 征2

(1.广东药学院附属第一医院，广东广州 510080；2.长春中医药大学第一附属医院，吉林长春 130021)

目的：观察益肾解毒通络汤对实验性糖尿病肾病的影响。方法：以链脲菌素诱导的糖尿病大鼠为动物模型，经益肾解毒通络汤10 ml/kg体重（相当于30 g生药/kg）治疗12周后，检测空腹血糖、HbA1C、血脂、血肌酐、尿素氮、24 h尿蛋白定量，采用放免法检测血清TNF-α的表达水平。结果：益肾解毒通络汤明显改善DM大鼠的一般状态，降低血糖，改善肝功能、肾功能，减少血清中TNF-α水平。结论：益肾解毒通络汤对实验性DM大鼠肾脏有保护作用，其机制可能与调节糖代谢和脂代谢，改善肾功能，减少尿蛋白排出，降低血清TNF-α水平有关。

糖尿病肾病；益肾解毒通络汤；肿瘤坏死因子-α

糖尿病肾病（DN）属糖尿病(DM)微血管病变性疾病，是在临床常见的糖尿病慢性并发症。早期表现为尿中排出微量清蛋白，继之出现临床蛋白尿，最终进展为慢性肾功能不全。研究表明，肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和糖尿病肾病的发生关系密切。益肾解毒通络汤为南征教授的临床经验方,具有益气养阴、活血祛瘀、降糖解毒之功效，用于治疗消渴肾病气阴两虚挟瘀毒证。本实验着重观察益肾解毒通络汤对糖尿病大鼠血清TNF-α的影响,为解释益肾解毒通络汤的功效提供现代医学的理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料

药品：益肾解毒通络汤（方剂组成为生地、黄芪、知母、枸杞子、大黄、黄连、陈皮、双花、榛花、丹参、坤草、土茯苓）由长春中医学院制剂室提供，在水浴中浓缩成3 g生药/ml浓缩液；阳性对照药－吡格列酮，由江苏恒瑞医药股份有限公司提供，批号：国药准字H20040631；链脲佐菌素(STZ)为Sigma公司产品。

试剂：尿蛋白酶免法试剂盒为上海德波生物技术有限公司出品；血糖高灵敏试剂盒购自长春生物工程技术有限公司；血清肿瘤坏死因子试剂盒为解放军总医院科技开发中心放免研究所出品。

实验仪器：LD5-2A医用离心机（北京医用离心机厂产品），UV755B分光光度计（上海精密仪器有限公司产品），DG-3022A酶联免疫检测仪（国营华东电子管厂产品），日立7510型生化自动分析仪（日本）。

实验动物：清洁级雄性Wistar大鼠由吉林大学基础医学院动物室提供。合格证号：SYXK(吉)2003-0001号。

1.2 方法

取雄性Wistar大鼠（体重180～220 g）60只，禁食不禁水12 h，按体重随机分为两组，正常对照组10只，DM模型组50只。模型组参照文献方法，采用链脲菌素(STZ)诱导的糖尿病法，单次腹腔注射STZ 50 mg/kg，正常对照组仅腹腔注射等体积上述缓冲液。注射STZ 72 h后，尾静脉采血测定空腹血糖及尿糖。取血糖≥16.7 mmol/L，尿糖+++以上者，再按体重随机分为益肾解毒通络汤组（15只）、阳性对照组（15只）和模型对照组（15只）。于注射STZ后 7 d，中药实验组每日上午灌服益肾解毒通络汤浓缩液10 ml/kg体重（相当于30 g生药/kg），阳性对照组每日上午灌服吡格列酮5 mg/kg体重，DM模型组和正常对照组每日上午灌服等体积饮用水，连续灌服12周。于服药终末收集24 h尿量，测定尿蛋白量。次日将大鼠眼眶采血，检测空腹血糖、HbA1c、血脂、血肌酐及尿素氮。血清TNF-α按照试剂盒说明书要求进行操作，最后在γ放射免疫计数器上测定放射性。最后，用0.9%NaCl溶液灌洗肾脏，剖取肾脏，滤纸吸干，去掉包膜，即刻称重。

2 结果

2.1 一般情况

正常对照组的大鼠体重明显增加，精神状态良好，反应灵敏，动作自如，毛发平伏有光泽，无一只死亡。DM模型组的大鼠明显消瘦，多饮、多食、多尿明显；且精神萎靡，反应迟钝，动作迟缓，毛竖无光泽，弓背蜷体，部分出现烂尾、肢体感染溃烂、白内障（6只）等并发症，其中有5只因衰竭或出现并发症而死亡。吡格列酮组也出现类似表现和并发症，但程度较轻，阳性对照组3只死亡。中药实验组大鼠精神状况、反应、毛色较正常组差，但比DM模型组、阳性对照组好，无合并白内障，实验过程中有3只死亡。

2.2 益肾解毒通络汤对糖尿病大鼠血糖、HbA1c及TNF-α的影响

结果表明，注射STZ后12周大鼠的血糖、糖化血红蛋白及肿瘤坏死因子明显增高，与正常对照组比较差异明显。经12周治疗后，益肾解毒通络汤组和吡格列酮组则明显降低，与模型组相比较，差异有统计学意义（P<0.05或P<0.01），且其作用强度前者略高于后者，但差异无统计学意义。见表1。

表1 各组实验大鼠12周末空腹血糖、HbA1c、血清TNF-α比较（±s）

表1 各组实验大鼠12周末空腹血糖、HbA1c、血清TNF-α比较（±s）

与正常对照组比较，*P<0.05，**P<0.01；与DM模型组比较，#P<0.05，##P<0.01

正常对照组DM模型组益肾解毒通络汤组吡格列酮组组别 例数（n）10 10 12 12血糖（mmol/L）5.89±0.49 18.81±3.46**13.74±2.75**##14.16±2.56**##HbA1c（%）3.28±0.52 6.43±1.03**4.30±0.81**##4.70±0.84**##TNF-α（mg/ml）1.57±0.16 3.71±0.43*2.43±0.44*#2.57±0.39*#

2.3 益肾解毒通络汤对糖尿病大鼠TG、TC、血清BUN、Scr的影响

结果表明，注射STZ后12周大鼠的血脂（TG、TC）明显升高，肾功能（BUN、Scr）显著升高，与正常对照组比较差异显著。经12周治疗后，益肾解毒通络汤组和吡格列酮组则明显降低血脂，其中TG降低幅度前者明显大于后者，差异有统计学意义（P<0.05）；肾功能（BUN、Scr）障碍均明显改善，且其改善程度前者略高于后者，但差异无统计学意义。见表2。

表2 各组实验大鼠12周末TG、TC、血清BUN、Scr比较（±s）

表2 各组实验大鼠12周末TG、TC、血清BUN、Scr比较（±s）

与正常对照组比较，*P<0.05，**P<0.01；与DM模型组比较，#P<0.05，##P<0.01；与吡格列酮组比较，▲P<0.05

组别 例数（n）TC（mmol/L）正常对照组DM模型组益肾解毒通络汤组吡格列酮组10 10 12 12 1.41±0.32 2.64±0.56**1.90±0.59*##1.96±0.59*##TG（mmol/L）0.66±0.16 1.61±0.32**0.94±0.30*##▲1.26±0.39**#BUN（mmol/L）6.75±0.38 20.16±4.59*11.24±4.04*#12.22±3.63*#肌酐（μmol/L）49.16±9.59 91.42±12.48*68.62±11.07*#70.03±9.76*#

2.4 益肾解毒通络汤对糖尿病大鼠尿蛋白量和肾重量的影响

见表3。注射STZ 12周后大鼠的尿蛋白和肾脏重量明显增加，与正常对照组比较差异显著。益肾解毒通络汤和吡格列酮均明显降低尿蛋白量和肾脏重量，表明该药对高糖所致的肾脏微血管损伤有明显的改善作用。

表3 各组实验大鼠12周末24 h尿蛋白定量比较（±s）

表3 各组实验大鼠12周末24 h尿蛋白定量比较（±s）

与正常对照组比较，*P<0.05，**P<0.01；与DM模型组比较，#P<0.05，##P<0.01

正常对照组DM模型组益肾解毒通络汤组吡格列酮组组别 例数（n）10 10 12 12尿总蛋白（mg/24 h）13.88±4.15 51.86±20.79*20.19±9.27#21.26±8.53#左肾重（g）0.88±0.15 1.39±0.87**1.03±0.10**##1.12±0.10**##肾重/体重（mg/g）2.75±0.23 7.42±0.32**4.23±0.16**##4.65±0.16**##△

3 讨论

研究证明，高血糖所致的非酶糖化蛋白蓄积是引起糖尿病慢性并发症的关键因素[1]。糖尿病的非酶蛋白糖基化并非只限于血红蛋白[2-3]，而是有全身倾向的，若蛋白质分子间发生交联形成稳定的终末代谢产物（AGEs），易于发生病理效应。糖尿病肾病是糖化蛋白AGEs积聚于肾脏，刺激肾小球系膜细胞释放细胞外基质成分，导致肾小球基底膜增厚、肥大、硬化等病理改变。本实验证明，益肾解毒通络汤对血糖及糖化血红蛋白的形成有明显的抑制作用，提示该药具有预防肾小球病变的形成或改善其病变的作用。吡格列酮属胰岛素增敏剂，可减少外周组织和肝脏的胰岛素抵抗，增加依赖胰岛素的葡萄糖的处理，并减少肝糖的输出。但本实验结果它的降血糖及糖化血红蛋白强度略逊于益肾解毒通络汤，这可能是由作用靶点过于局限所致。

TNF-α被认为是一种潜在的致纤维化因子，作为炎症介质在炎症急性期及硬化过程中起重要作用[4]。Nakamura T等[5]发现DM 4周后，DM小鼠肾小球TNF-α mRNA水平增加2倍，12周后增加3倍，24周后增加4.2倍。研究发现DN中，血清TNF-α和IL－18明显升高，并且随着不同临床阶段而升高，在大量蛋白尿阶段最高[6-7]。近来研究证明，肿瘤坏死因子（TNF-α）是导致DN早期肾小球血流动力学异常的主要介质[8]，也是高糖时由晚期糖化终末产物（AGEs）所释放的另一种因子。它可致使诱导型一氧化氮合酶（iNOS）活性增加，一氧化氮（NO）过量产生。过量的NO在DN病理生理过程中起着重要作用。本实验表明，益肾解毒通络汤和吡格列酮均能降低血清TNF-α，对肾脏起到一定保护作用。

DN常发生脂质代谢紊乱，促使肾脏的损伤。故控制脂质代谢紊乱也是保护DN肾脏的关键措施。本实验又证明，益肾解毒通络汤具有一定的调节脂代谢作用，能降低DM大鼠TC、TG水平，其中降低TG幅度明显大于吡格列酮。说明，益肾解毒通络汤的改善脂质代谢异常、防止肾脏损伤是另一种作用途径。

蛋白尿及肾脏肥大是DN早期的主要病理效应，与之相应的病理改变是肾小球基底膜上负电荷丢失、通透性增加、肾小球系膜细胞、肾小管上皮细胞等增生，肾组织体积增大。本实验结果,益肾解毒通络汤和吡格列酮明显降低尿蛋白量，肾重/体重比值低于模型对照组（P<0.01），表明，该药具有治疗糖尿病肾病的直观依据。

综上所述，益肾解毒通络汤具有调节糖代谢和脂代谢、抑制肾脏肥大、降低血清TNF-α水平和尿蛋白量等作用。该药是是一种多靶点、多途径的中药复方制剂，对糖尿病肾病的预防及治疗具有十分重要的意义。

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The effect of Yishen Jiedu Tongluo Recipe on tumor necrosis factor-α in diabetic nephropathy rats

JIN Yinghua1,NAN Zheng2
(1.The First Affiliated Hospital of Guangdong Pharmaceutical University,Guangdong Province,Guangzhou 510080,China;2.The First Affiliated Hospital of Changchun University of Traditional Chainese Medicine,Jilin Province,Changchun 130021,China)

Objective:To observe the effect of Yishen Jiedu Tongluo Recipe (YSJDTLR)on tumor necrosis factor-α in diabetic nephropathy rats.Methods:The diabetic nephropathy models of rats(n=60)were produced by inducement of Streptozotocin(50 mg/kg)．The blood glucose,glycol-hemoglobin,TC,TG,BUN,SCR,the level of 24 h Urine protein,tumor necrosis factor-α,and Urine protein were measured at 12 weeks after"YSJDTLR"(10 ml/kg)were treated with rats.TNF-α was measured by methods of radioimmunoassay..ResultsThe blood glucose,glycol-hemoglobin,tumor necrosis factorα,TC,TG,BUN,SCR and Urine protein were decreased after YSJDTLR(10 ml/kg)treatment compared with the DM group.Conclusion:The study suggests that YSJDTLR has protective effect on DM rats.The mechanisms might related to the regulation of glucose metabolism and lipid metabolism,and the improvement of kidney function,also decrease of TNF-α.

Diabetic nephropathy;Yishen Jiedu Tongluo Recipe;Tumor necrosis factor-α

R587.2

A

1674-4721（2010）12（a）-017－03

金英花（1979-），硕士研究生学历；广东药学院附属第一医院中医科。

2010-10-15）