人结肠癌细胞株CW-2干细胞生物学特性研究

刘美，艾亮，陈宓，龙浩，李少林

（重庆医科大学 基础医学院放射医学教研室，重庆 400016）

癌干细胞理论认为，结肠癌发生、复发、转移、耐药的根源是肿瘤内部一小部分具有自我更新、多向分化潜能的细胞，即癌干细胞（cancer stem cell，CSC）［1，2］分离并对结肠癌干细胞生物学特性的研究对结肠癌的诊断、治疗具有十分重要的意义。本实验应用无血清悬浮培养+奥沙利铂+流式细胞分选技术（多重联合法）逐步分离纯化人结肠癌细胞株CW-2干细胞，并对其生物学特性进行研究［3～6］。

1 材料与方法

1.1 材料

人结肠癌细胞株CW-2购自中国科学院上海生命科学院细胞库；RPMI 1640和DMEM/F12培养基购自Hyclone公司；胰酶购自Gibco公司；重组人表皮细胞生长因子（epidermal growth factor，EGF）、重组人白血病抑制因子（leukemia inhibitory factor，LIF）、重组人碱性成纤维生长因子（fibroblast growth factor-basic，bFGF）购自 Sinobio 公司；青霉素 G、链霉素购自华北制药股份有限公司；奥沙利铂购自深圳海王药业有限公司；Anti-CD44-FITC、Anti-Ep－CAM-PerCP-Cy5.5和其同型抗体购自BD Bioscience公司；Transwell小室购自Costar公司；24孔板购自Corning公司；Matrigel胶购自BD Bioscience公司。

1.2 方法

1.2.1 CW-2细胞在传统含血清培养基（serum-supplemented medium，SSM）中常规培养。

1.2.2 无血清悬浮培养+奥沙利铂富集结肠癌CW-2干细胞：

将SSM中处于对数增长期的细胞以105/ml接种于由 DF12（DMEM/F12）、EGF（20 ng/m1）、bFGF（10 ng/m1）、LIF（10 ng/m1）组成的无血清培养基（serum-free medium，SFM）中传代培养。另培养基中添加青霉素 G（l00 U/ml）、链霉素（100 U/ml）和奥沙利铂（1 μg/m1）。药物处理24 h后800 r/min离心5 min去除化疗药物奥沙利铂，重新加入无血清培养液，继续培养。前2周直接向培养瓶中加入培养液。2周后通过胰酶消化法和机械吹打法分离成单细胞悬液后传代。每日观察CW-2细胞在SFM中形成肿瘤干细胞球的过程。

1.2.3 流式细胞仪分选：

将SFM+奥沙利铂处理14 d后细胞球消化、离心、PBS清洗、荧光抗体标记后在FACS上分选出CD44+EpCAM+和 CD44－EpCAM－细胞。

1.2.4 流式细胞检测CD44、EpCAM的表达：

流式细胞仪分选后CD44+EpCAM+细胞上流式细胞仪分析检测CD44+EpCAM+细胞比例。

1.2.5 细胞周期检测：

收集 FACS 分选后 CD44+EpCAM+和 CD44－Ep－CAM－细胞悬液，上流式细胞仪进行细胞周期检测。

1.2.6 动物致瘤实验：

4～5周龄NOD/SCID三联免疫缺陷小鼠由重庆医科大学实验动物中心提供，性别不限。随机分成SSM 组、CD44+EpCAM+细胞组、CD44－EpCAM－细胞组，将SSM培养细胞、多重联合分选后CD44+Ep－CAM+细胞、CD44－EpCAM－细胞收集后调为所需浓度，按1∶1比例与Matrigel混合，均以104个细胞数量接种NOD-SCID小鼠右肩部皮下。每周2次观察肿瘤生长状况，测量并记录第 4，7，14，21，28 d 肿瘤的体积。

1.2.7 Transwell侵袭实验：

将 10 mg/ml的 Matrigel胶与 RPMI 1640培养液按1∶5的比例混合，每孔取60 μl混合液均匀铺与Transwell小室的聚碳酸酯微孔膜上制成人工基底膜。37℃温育30 min使胶固化。下室内加入600 μl趋化因子（3T 3上清液）：胎牛血清培养液比例为1∶1的混合培养液，上室内分别加入500 μl血清悬浮培养细胞+SSM、CD44+EpCAM+细胞+SFM，CD44－EpCAM－细胞+SSM，各组细胞密度均为 3×105/ml，每组设6个相同的孔。在37℃、5%CO2饱和湿度培养箱中培养。72 h后×200倒置显微镜下观察下室内细胞，计数每个×200镜视野下细胞的数量，每下室记3个视野后取平均值。

1.3 统计学分析

运用SPSS 11.0统计分析软件进行多重测量设计资料的方差分析、完全随机设计资料的方差分析，P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 流式细胞学检测

多重联合分选后双阳性细胞中CD44+EpCAM+癌干细胞含量为89.57%。

2.2 细胞周期检测

CD44+EpCAM+细胞处于低增殖状态，G0/G1期细胞占86.19%，G2+S期细胞占13.81%，而CD44－Ep－CAM－细胞相对处于高增殖状态，G0/G1期细胞占56.04%，G2+S细胞占43.96%（图 1）。

2.3 体外侵袭实验

多重联合分选后CD44+EpCAM+细胞组、SSM组和CD44－EpCAM－细胞组下室细胞均数分别为188个/视野、56个/视野、0个/视野。各组间差异有统计学意义（P＜0.05）。结果提示，多重联合分选后CD44+EpCAM+癌干细胞的侵袭能力大于单纯SSM培养细胞和 CD44－EpCAM－细胞（图 2）。

2.4 体内成瘤实验

CD44＋EpCAM＋细胞组 4 d 可触及肿瘤，SSM 组14 d才可触及肿瘤，而CD44－EpCAM－细胞组始终无肿瘤生长。测量并记录 4 d、7 d、14 d、21 d、28 d 肿瘤的体积。各组间差异有显著统计学意义（P＜0.05）。可见多重联合分选后的CD44+EpCAM+细胞的成瘤能力明显强于SSM培养细胞和CD44－EpCAM－细胞（图 3）。

3 讨论

肿瘤干细胞分选方法的选择是获得癌干细胞的关键。提高癌干细胞的纯度是目前国内外学者们研究的重点。本实验以结肠癌细胞株CW-2为研究对象，将无血清悬浮培养法、化疗药物法、流式细胞分选法联合起来逐步分离出了纯度高达89.57%的CD44+EpCAM+癌干细胞，获得了较以往［3，7］纯度更高的癌干细胞。

同时本实验在获得纯度相对较高癌干细胞的基础上，还通过细胞周期检测、体外侵袭实验、体内成瘤实验［8］对 CD44＋EpCAM＋癌干细胞进行生物学特性研究。研究发现CD44＋EpCAM＋癌干细胞具有比普通细胞和非癌干细胞更强的成瘤能力、侵袭能力和增殖能力。

研究结果表明，CD44＋EpCAM＋癌干细胞是一群具有高致瘤性、高侵袭性、低增殖性细胞。通过本实验我们不但提高了所得癌干细胞的纯度，还进一步深化了癌干细胞的生物学特性研究。为癌干细胞理论研究和临床实践奠定了坚实的基础，为肿瘤的治疗开辟了新的道路。

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