与人巨细胞病毒UL130编码蛋白相互作用蛋白的筛选

任高伟，崔鑫，齐莹，马艳萍，阮强，孙峥嵘

（中国医科大学 附属盛京医院病毒研究室，沈阳 1 1 0 0 0 4）

人巨细胞病毒（human cytomegalovirus，HCMV）在免疫功能低下的个体如HIV、器官移植患者其感染通常是致命性的［1］。

近年来的研究表明，HCMV UL/b’区相邻的UL131A-128基因具有编码蛋白的功能。在HCMV的感染过程中，UL131A-128基因参与病毒在体内内皮细胞的复制、白细胞之间的播散以及树突状细胞调节的免疫反应［2］，而UL130作为该座位点中最大的基因，其不仅是唯一没有内含子的基因，而且为晚期表达基因［3］，其编码的蛋白是一种在感染的细胞中无效分泌的腔隙糖蛋白，但却可以以一种成熟的高尔基复合体形式整合到病毒的外膜［4］，而且pUL130是病毒感染内皮和上皮细胞过程中一种重要的糖蛋白之一［5］。

病毒在内皮细胞的增殖及病毒从内皮细胞转移到白细胞和树突状细胞中的病毒播散过程，可能是HCMV感染致病机制的关键。因此，很有必要运用分子生物学实验方法研究UL130基因编码蛋白的生物学功能，这对揭示HCMV感染的致病机制十分重要。

本研究应用酵母双杂交技术从人胎脑cDNA文库中筛选出与人巨细胞病毒UL130基因编码蛋白相互作用的蛋白。最终从蛋白水平探讨HCMV先天感染的致病机制，为揭示HCMV先天感染致病机制、解决人巨细胞病毒先天感染的防治、减少先天畸形儿出生等医学问题奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

标本来自中国医科大学附属盛京医院病毒室保存的临床低传代HCMV分离株H（传代<5次）。HCMV分离株H UL/b’基因序列已被GenBank收录，序列号为：GQ981646。酵母双杂交系统Match－maker GAL Two-Hybrid System购自Clontech公司；MatchermakerTM cDNA Libraries人胎脑cDNA文库由武汉大学生命科学院肖庚富教授惠赠。筛选所用相关试剂购自Sigma公司；BECKMAN台式低温高速离心机；Perkin Elmer PCR循环仪；电穿孔仪（Bio－Rad）；引物合成及测序由Invitrogen公司完成。

1.2 方法

1.2.1 酵母表达重组质粒pGBKT7-UL130的构建：依据HCMV低传代分离株、组织及尿标本的DNA提取方法，从HCMV分离株H中提取DNA，并以此作为HCMV UL130基因扩增模板。按照HCMV分离株 HUL/b’基因序列（序列号为：GQ981646），应用引物设计软件Oligo 6.0设计用于扩增HCMV UL130全序列的引物，并根据载体pGBKT7的多克隆位点序列，分别加入了EcoRⅠ及BamHⅠ识别位点（下划线）以及保护性碱基。引物序列如下：上游引物：5′CCGGAATTCTTGTCGACCCTGCGGCTTCT GCTTCGTCAC 3′；下游引物：5′CGCGGATCCGGTACCTCAAACGATGAGATTGGGATG 3′。

应用PCR技术以HCMV DNA为模板扩增出UL130基因的序列。反应体系为50 μl，PCR条件为：94℃变性45 s，50℃退火 1 min，72℃延伸 1 min，共30个循环。将UL130扩增产物纯化后用EcoRⅠ和BamHⅠ进行双酶切，与同样双酶切的载体pGBKT7纯化后，在T4 DNA连接酶的作用下连接。将连接产物转化入大肠杆菌TG1中，转化后的TG1接种于含有卡那霉素的LB固体培养基，37℃温箱过夜。利用PCR方法扩增菌落，电泳观察筛选出阳性结果，挑取阳性克隆，经含卡那霉素的LB液体培养基培养过夜后，菌液测序验证克隆结果。

1.2.2 应用酵母双杂交技术筛选人胎脑cDNA文库中与HCMV UL130编码蛋白相互作用的蛋白：（1）将以pACT2（含转录激活域）为酵母表达载体的人胎脑cDNA文库增殖，采用碱裂解法提取文库质粒。（2）将重组质粒pGBKT7-UL130转化到酵母细胞AH109中，然后再将提取的文库质粒转化到含有pGBKT7-UL130的酵母细胞AH109中，转化后的菌液分别涂二缺（亮氨酸/色氨酸缺陷，-Leu/-Trp）、四缺平板（腺嘌呤/组氨酸/亮氨酸/色氨酸，-Ade/-His/-Leu/-Trp）。在二缺平板观察转化效率，四缺平板上长出的克隆参照酵母双杂交系统操作说明做显色反应。（3）将显蓝色的酵母克隆增值并用玻璃珠法提取酵母质粒后，应用电穿孔转化方法将酵母质粒转化到大肠杆菌中，在含氨苄青霉素的平板筛选出阳性克隆。（4）采用PCR方法剔除重复克隆，提取大肠杆菌中的文库质粒并将其回转到含重组质粒pGBKT7-UL130的酵母菌中观察其在二缺及四缺缺陷培养基上的生长结果。计算其转化效率，计算公式为 cfu×total suspension vol（μl）/Volplated（μl）×dilution factor×μg DNA used。将与 HCMV-UL130相互作用的人胎脑cDNA文库基因测序，利用Gen Bank的数据库资源，运用BLAST应用程序分析测序结果。

2 结果

2.1 重组质粒pGBKT7-UL130的成功构建及鉴定

采用特异性引物扩增HCMVUL130基因片段，其片段长度为645 bp，将HCMVUL130片段成功克隆到酵母表达载体pGBKT7上（图1），并命名为pGBKT7-UL130。pGBKT7-UL130克隆的鉴定采用pGBKT7质粒两端的上、下游引物，应用PCR技术鉴定含pGBKT7-UL130质粒的阳性克隆，测序分析显示结果与预期一致（图2）。

2.2 将重组质粒pGBKT7-UL130成功转化到酵母菌AH109中

用小剂量醋酸锂法将重组质粒pGBKT7-UL130转化酵母细胞 AH109中，在色氨酸缺陷（SD/-Trp）的培养基上进行筛选，由于酵母细胞AH109株为SD/-Trp，而以pGBKT7为表达载体的诱饵蛋白可以诱导酵母细胞AH109产生Trp，结果显示转化pGBKT7-UL130的酵母细胞AH109在SD/-Trp的培养基上成功生长。

2.3 将人胎脑cDNA文库成功转入含有重组质粒pGBKT7-UL130的酵母菌AH109中

利用大剂量醋酸锂转化方法将人胎脑cDNA文库转入含有重组质粒pGBKT7-UL130的酵母菌AH109中，转化后分别铺板于SD/-Trp/-Leu，SD/-Trp/-Leu/-Ade/-His两种营养缺陷的培养基中，30℃温箱中孵育5 d后，在15个四缺培养基中观察到有15个酵母菌落生长，通过二缺培养基中的菌落数大约300左右，转化效率0.15×104cfu/μg，转化效率略低，为了避免文库信息丢失故而进行了多次筛选。

2.4 鉴定筛选出的阳性克隆质粒

筛选的阳性克隆通过增值菌落后观察及显色反应排除假阳性结果后将剩余的9个克隆提取质粒，并通过电穿孔的方法转化入感受态细胞TG1中。在含有氨苄青霉素的LB固体培养基中，37℃温箱过夜培养。在每个LB固体培养基中随机选取5个克隆，应用PCR技术，以文库质粒载体pACT-2的引物进行扩增，观察到随机选取的5个克隆，其插入的片段大小不等（图3）。

2.5 阳性文库质粒回转入含重组质粒pGBKT7-UL130的酵母菌AH109中进行再次验证及测序分析结果

将阳性文库质粒回转入含重组质粒pGBKT7-UL130的酵母细胞AH109后，在二缺和四缺培养基中均生长，测序结果及BLAST分析结果见表1。

表1 阳性克隆与G e n e b a n k同源序列比较F i g.1 C o mp a r i s o n o f t h e s e q u e n c e o f p o s i t i u e c l o n e s a n d h o mo l o g o u s g e n e s f r o mG e n e b a n k

3 讨论

酵母双杂交是一种在细胞内检测蛋白质的相互作用的技术，无需分离纯化蛋白质，是实现大规模高通量分析的主要方法。真核转录因子含有两个相对独立的功能域：DNA结合域（DNA binding domain，BD）和转录激活域（activation domain，AD）。当两者相互接近，即可激活转录。酵母双杂交技术即利用上述特性，将两个重组体在同一酵母细胞中表达，产生的融和蛋白分别称之为诱饵和猎物蛋白。如果蛋白质X和Y之间存在相互作用，则BD和AD被拉近，转录活性恢复，即可激活下游报告基因的表达。因此，应用酵母双杂交，可以分析已知蛋白质之间是否存在相互作用，确定发生相互作用所必需的功能域；也可以从已知蛋白质出发，探索和该蛋白质存在相互作用的未知蛋白质。本研究通过构建转录结合域重组质粒pGBKT7-UL130，并将其对构建于转录激活域的酵母人胎脑细胞cDNA文库进行双杂交筛选，最终得到了15个阳性克隆并进行测序分析，发现9个克隆基因编码的蛋白与7种蛋白的部分序列高度同源。

HCMV感染可引起患儿的神经系统及消化系统的多种疾病，已成为引起新生儿疾病和先天畸形的重要感染因素之一，本实验初步结果表明，UL130能与突触小体相关蛋白相互作用。SNAP在突触小体的对接和融合过程中起到重要的作用并参与细胞内蛋白的运输，神经递质的分泌和胞吐过程。

突触蛋白（synapsins）是一组与突触小泡相关的具有神经元特异性的磷酸蛋白，几乎分布于所有的神经终末处，并位于突触前膜的表面。突触小泡膜蛋白（snapin）［6］通过直接结合突触小体相关蛋白（SNAP of 25 kDa，SNAP25）而与可溶的 N-己基顺丁烯二酰亚胺敏感因子吸附蛋白受体（SNARE）的核心复合体相连，从而调节（促进）SNARE核心复合体与突触结合蛋白（synaptotagmin）的相互作用。将外源性重组snapin羧基端肽段注入突触前神经元胞体抑制神经递质的释放，通过竞争性抑制内源性snapin与SNARE核心复合体的结合，从而削弱了synaptotagmin与SNARE核心复合体的相互作用。进一步对snapin的研究发现［7］，snapin经PKA磷酸化后与SNAP25的结合显著增加，而且PKA磷酸化的snapin可增强synaptotagmin与SNARE核心复合体的结合，从而促进神经递质的释放。

突触膜糖蛋白（synaptophysin，p38）是突触小泡膜的特异性组成蛋白［8］，在中枢、外周神经系统和神经内分泌细胞中均有表达，在神经系统的发育、疾病、损伤和再生等的研究中具有重要意义。p38是位于突触小泡膜上的糖蛋白，Thomas等［9］发现p38的跨膜结构、电导值范围与通道蛋白相一致，与通道蛋白具有共同的功能特征，即p38可能构成突触小泡的特异性膜通道，可转运低分子复合物，允许胞质和小泡内部之间进行物质交换。p38与Ca2+结合后诱导小泡膜去极化，启动小泡膜与突触前膜连接，与突触前膜上的一种通道蛋白形成间隙连接样的孔道结构，使神经递质由小泡释放至突触间隙，即p38参与突触小泡膜与突触前膜的融合和神经递质的释放［ 7，8］。

HCMV UL130与snapin之间的关系，目前未见文献报道。我们通过研究发现，HCMV UL130与snapin之间存在相互作用的关系，故而推测因人巨细胞病毒感染引起的婴幼儿神经系统疾病时HCMV UL130编码的蛋白可能会影响到snapin相关蛋白发挥正常作用而引起临床症状。我们所做的研究可能为从蛋白水平探讨HCMV先天感染的致病机制提供有价值的线索。

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［5］Yamada S，Nozawa N，Ratano H，et al.Characterization of the guinea pig cytomegalovirus genome locus that encodes homologs of human cytomegalovirus major immediate-early genes，UL128，and UL130［J］.Virology，2009，391（1）：99-106.

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［9］Thomas L，Hartung K，Langosch D，et al.Identification of synaptophysin as a hexameric channel protein of the synaptic vesicle membrane［J］.Science，1988，242（4881）∶1050-1053.