bFGF复合骨基质明胶在兔股前区促血管化作用

单伟，秦书俭

（辽宁医学院 解剖学教研室，辽宁 锦州 121001）

目前，促进组织工程骨血管化的主要研究方向是：（1）血管网包裹术；（2）组织工程化预构骨瓣；（3）血管内皮细胞复合；（4）血管束植入技术；（5）生长因子掺入［1］。要实现组织工程骨的血管化，必须还要有促血管生成因子的存在，骨折局部虽然有促血管生长因子的聚集，但加入外源性的生长因子可能会加快组织工程骨的血管化，从而加速骨折愈合。关于外源性生长因子和血管束植入相结合促进血管化的研究国内外还未见报道。成纤维细胞生长因子（basic fibroblast growth factor，bFGF） 是目前实验中常用的促血管生长因子之一，它不仅可以促进内皮细胞的生长和血管的形成，而且还可以诱导外周的内皮细胞前体到移植区，具有很强的促血管新生能力，在伤口愈合和组织修复中发挥重要作用。因此，本实验旨在探讨bFGF对骨基质明胶（bone matrix gelatin，BMG），包埋血管束在兔股前内侧区的促血管化作用，为组织工程骨的血管化研究奠定基础。

1 材料与方法

1.1 实验动物及试剂

健康5月龄日本大耳白兔40只，体质量1.5～2.0 kg，雌雄不限，由辽宁医学院实验动物中心提供（医动字第 SCXY（辽）2003-2007号）。bFGF（美国Sigma公司）、墨汁（北京）、Masson三色染色试剂盒（福州迈新生物技术开发有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 BMG的制备：

将4只日本大耳白兔用10%水合氯醛腹腔麻醉过量致死后取四肢骨、髂骨，去除软组织。四肢骨的骨干及骨髓，用大量蒸馏水清洗，参照Urist［2］的方法将四肢骨和髂骨制备成6 mm×4 mm×3 mm大小的BMG。

1.2.2 实验动物分组及BMG的植入：

将36只日本大耳白兔随机分为A、B、C 3大组，每组12只。A组：bFGF+血管束+BMG；B组：血管束+BMG；C组：BMG。每大组按照术后观察4周、8周、12周又分为3个小组，每小组4只。实验动物用10%水合氯醛（3 ml/kg）腹腔麻醉，无菌条件下手术，于股骨前内侧膝关节上方做一纵行切口，A组：分离隐动脉（股动脉分支）及其伴行静脉隐静脉，将隐动、静脉游离1 cm后顺行植入用2 μg/ml bFGF浸泡过的BMG的凹槽内；B组：分离隐动、静脉，将隐动、静脉游离1 cm后顺行植入未处理过的BMG的凹槽内；C组则直接将未处理过的BMG植入，不必分离隐动、静脉。最后将移植区作严密、逐层缝合，关闭手术切口。术后5 d每日用4万U庆大霉素肌内注射预防感染。

1.2.3 墨汁灌注及取材：

分别于手术后4周、8周、12周取各组动物，10%水合氯醛3 ml/kg腹腔麻醉后固定，在下腹部纵行切开皮肤、皮下组织，游离腹主动脉、下腔静脉，在腹主动脉离心插管，剪开下腔静脉，放血至动物循环停止，同时向动脉内注入大量肝素生理盐水（每500 ml生理盐水中加入肝素12500 U）冲洗血管，直至静脉远端流出无色液体时为止，然后从腹主动脉注入配好的复合墨汁（墨汁、甲醛及生理盐水体积比为3∶1∶6），远端皮肤、趾甲均已变黑时结扎下腔静脉远端和近端开口，继续灌入少量复合墨汁，当阻力增大肢体饱胀难以注入时停止，结扎动脉保持血管内压力。低温放置24 h后取出植入物置入4%多聚甲醛溶液中固定24 h。

1.2.4 透明标本的制作及观察：

取固定好的植入物，A、B、C 3个组每个时间点各取2块，按照以下步骤制作透明标本：（1）脱钙：将移植物放入 0.6 mol/L HCl脱钙 3 d；（2）去酸：将脱钙标本置于蒸馏水中浸泡3 d去酸，每日换水2～3次，然后在自来水下连续冲洗1 h；（3）漂白：将去酸标本用5%过氧化氢漂白1 d，再流水冲洗1 h；（4）脱水：将漂白后标本用滤纸吸干，然后依次将其置于50%、60%、70%、80%、95%乙醇和无水乙醇逐级脱水各2 d；（5）透明和保存：将标本放于二甲苯中半透明7～14 d，最后移入冬青油中透明、保存。从中央纵向剖开用肉眼观察移植物血管形成情况并摄像。

1.2.5 Masson染色组织学观察及定量分析：

将剩余的固定好的植入物石蜡包埋、切片，厚度为5 μm，进行Masson染色，倒置显微镜下观察血管化及成骨情况，摄像。以CIAS-1000细胞图像分析系统测算其新骨面积比及血管面积比。

1.3 统计学分析

采用SPSS 13.0统计软件包处理所测得的数据，作多个样本均数的两两比较，α＝0.05作为检验水准；同时作新生骨面积比和血管面积比的相关分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 一般情况

所有实验动物术后4～6 h苏醒，并能站立进食。术后切口无感染，下肢无坏疽，伤口Ⅰ期愈合，均存活至完成试验。

2.2 组织学观察

术后4周，3组移植物边缘均可见少量纤维结缔组织和小血管形成，A组移植物中央有少量的血管，B组移植物中央血管较A组少。术后8周，3组移植物边缘长入的纤维结缔组织和小血管明显增多，血管排列紊乱，A组移植物中央血管量增加，B组有少量血管，支架材料逐渐开始降解吸收，以A组降解吸收为最快，在血管周围有新生软骨组织形成，C组未见新骨形成。术后12周，A组材料已大部分被吸收，被新生软骨和骨组织代替，位于其中的新生血管排列较有序（图1），B组材料也大部分被吸收，被新生软骨组织和骨组织代替，位于其中的新生血管逐渐趋向于有序排列（图2），C组材料也有吸收，但仍由大量纤维结缔组织充填，新生血管排列杂乱，主要集中于材料边缘，中央较少（图3）。

2.3 血管面积定量分析

移植物血管面积图像分析结果见表1。从表中可以看出：4周，A组、B组、C组之间互相都有统计学差异（P＜0.05）；8周，A 组、B组、C 组之间互相有统计学差异（P＜0.05）；12周，A 组与 B、C 组差异有显著性（P＜0.05）。而且各组中随着时间的延长，移植物血管面积逐渐增加。

2.4 新生骨面积定量分析

移植物新生骨面积图像分析结果见表2。从表中可以看出：4周，A、B组与C组之间都有显著性差异（P＜0.05）；8周，A 组、B组、C 组之间互相都有显著性差异（P＜0.05）；12周，A、B 组与 C组有显著性差异（P＜0.05）。

表1 移植物血管面积比比较（±s，%）Tab.1 Comparison of the ratio of neovascularization areas in the implant（±s，%）

表1 移植物血管面积比比较（±s，%）Tab.1 Comparison of the ratio of neovascularization areas in the implant（±s，%）

1）compared with group A，P<0.05；2）compared with group B，P<0.05；3）compared with group C，P<0.05.

Group 4 weeks 8 weeks 12 weeks A 2.24±0.042），3） 2.46±0.272），3） 4.58±0.032），3）B 0.82±0.081），3） 1.03±0.191），3） 2.52±0.131）C 0.18±0.021），2） 0.48±0.111），2） 1.25±0.101）

表2 移植物新生骨面积比比较（±s，%）Tab.2 Comparison of the ratio of osteogenic areas in the implant（±s，%）

表2 移植物新生骨面积比比较（±s，%）Tab.2 Comparison of the ratio of osteogenic areas in the implant（±s，%）

1）compared with group A，P<0.05；2）compared with group B，P<0.05；3）compared with group C，P<0.05.

Group 4 weeks 8 weeks 12 weeks A 15.29±1.103） 27.35±1.612），3） 21.62±1.033）B 14.44±1.363） 22.64±1.421），3） 21.3±1.143）C 5.73±1.251），2） 14.61±1.561），2） 11.86±0.561），2）

2.5 新生骨面积比与血管化面积比相关分析

新生骨面积与血管面积图像分析结果见表3（γ4w=0.48，P ＜ 0.05；γ8w=0.52，P ＜ 0.05；γ12w=0.59，P＜0.05），新生骨面积比与血管面积比呈正相关。

3 讨论

骨移植后的3个基本过程是移植物血管化、骨再生及骨端融合。血管化是关键环节，其作用贯穿于整个移植物修复过程，对骨再生与融合的方式及效果起决定作用［3～5］。长段骨干缺损之所以修复难度大，与其特定解剖部位血供来源相对薄弱有密切关系。在骨修复中，微血管的长入，即血管化，能够将成骨细胞前体细胞、相关因子、营养物质及其他参与骨修复的细胞携带到局部微环境中，并带走局部新陈代谢产物，以及坏死和分解产物，从整体上维持有利于这一生理过程的代谢微环境［6，7］。本实验透明标本观察可以看出A组、B组在术后第4周时可见小血管以芽生的方式从血管束中长出，以后逐渐增多并开始向外周长入，术后第12周时与从材料边缘长入的血管形成吻合，相反C组材料中央的血管形成至12周时仍不明显。说明血管束植入的办法可以促进血管化，而且相对于血管网包裹而言可能具有更大的优点，血管束植入材料内部以后缩短了再血管化的距离，比较符合骨的生理血供特点。这与国内外学者的研究结果是一致的。Philippe等［8］将中空的复合骨髓基质细胞的珊瑚陶瓷材料置于大鼠大腿肌袋中，分离股动、静脉将其植入材料的管道内，发现血管束的植入明显促进了材料细胞复合物的血管化及成骨能力。杨志明等［5］将中空多孔管状羟基磷灰石材料消毒后通过中空管道植入兔动静脉血管束，保持近端的供血，研究表明，用血管束植入中空材料内，可有较快的血管化过程。

表3 移植物新生骨面积比与血管面积比分析结果（%）Tab.3Analysis of the ratio of osteogenic and neovascularization areas in implant（%）

另外，本实验中植入的血管束选用了隐动、静脉，隐动脉是股动脉发出的分支，走行长，位置也相对恒定，常与其隐静脉相伴行，而且植入材料内部以后由于没有阻断血供，不会造成动物术后下肢的坏疽，不影响其活动、进食。股三角区神经、血管的解剖部位也相对恒定，变异小，制作模型操作简单，并且模型的统一性和可重复性好，用来研究各种骨缺损的效果更为方便和科学，也能作为组织工程骨血管化、神经化重建研究的一种骨缺损动物模型。

bFGF是骨和软骨组织中的一种成分，它可以促进成骨细胞和软骨细胞的分裂增殖，在培养中抑制软骨细胞的最终分化；具有强大的促进成纤维细胞增殖能力，也是最早确认的促内皮细胞生长因子之一，有强大的内皮细胞趋化作用，具有很强的促血管新生能力；还在伤口愈合和组织修复中发挥着重要作用。本实验中bFGF可能起着促进成骨和促血管化的双重作用。虽然bFGF对许多细胞有作用，但备受关注的是其促进血管内皮细胞有丝分裂从而介导组织中新生血管形成的作用。

［1］金岩.组织工程学原理与技术［M］.西安：第四军医大学出版社，2004：10.

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［4］Kirkeby OJ，Nordsletten L，Skieldal S，et al.Circulation in corticocancellous bone grafts measured with laser Doppler flowmetry.An experimental study in rats ［J］.Scand J Plast Reconstr Surg Hand Surg，1994，28（4）：249-S54.

［5］杨志明，樊征夫，解慧琪，等.组织工程化人工骨血管化研究［J］.中华显微外科杂志，2002，25（2）：119-122

［6］Bruder SP，Fos BS.Tissue engineering of bone.Cell based strategies［J］.Clin Orthop Relat Res，1999（367 Suppl）：S68-S83.

［7］金丹，陈滨，裴国献，等.筋膜瓣促组织工程骨再血管化及山羊长段骨缺损的修复［J］.中华实验外科杂志，2005，22（3）：269-271.

［8］Philippe P，Villars F，Mathoulin-Pelissier S.Influences of vascularization and osteogenic cell on heterotopic bone formation within a madreporic ceramic in rats ［J］.Plast Reconstr Surg，2003，111（6）：1932-1941.