双水相萃取技术在分离、纯化中的应用

谭志坚，李芬芳，邢健敏

（中南大学化学化工学院，湖南 长沙 410083）

双水相萃取技术在分离、纯化中的应用

谭志坚，李芬芳，邢健敏

（中南大学化学化工学院，湖南 长沙 410083）

双水相技术是一种新型的液-液萃取技术，由于其条件温和、易操作等特点，目前已广泛应用于物质的分离、纯化。本文综述了双水相形成原理、工艺流程和特点、体系类别、影响双水相分配的因素及其在分离纯化中的应用，并针对其未来发展趋势进行了展望。

双水相萃取；分离纯化；应用

与传统的分离技术相比，双水相技术作为一种新型的分离技术，因其体积小，处理能力强，成相时间短，适合大规模化操作等特点[1]，已经越来越受到人们的重视。

Beijeronck在1896年将琼脂水溶液与可溶性淀粉或明胶水溶液混合，发现了双水相现象。双水相萃取(Aqueous two-phase extraction, ATPE)技术真正应用是在20世纪60年代，1956 年瑞典伦德大学的 Albertsson将双水相体系成功用于分离叶绿素，这解决了蛋白质变性和沉淀的问题[2]。1979年德国 Kula等人将双水相萃取分离技术应用于生物酶的分离，为以后双水相在应用生物蛋白质、酶分离纯化奠定了基础[3]。迄今为止，被成功应用于生物医药工程，天然产物分离纯化，金属离子分离等方面[4～6]。因其广泛的应用性，已经发展成为一种相对成熟的技术，但仍有很大潜在的价值等待我们去开发。

1 双水相的形成

1.1 双水相的形成机理

将2种不同的水溶性聚合物水溶液（或聚合物与一定浓度的盐溶液）混合时，当聚合物浓度（或盐的浓度）达到一定值，体系会自然分成互不相溶的两相，这就是双水相体系。双水相体系的形成主要是由于高聚物之间的不相溶性，一般认为只要两聚合物水溶液的憎水程度有所差异混合时就可发生相分离，且憎水程度相差越大，相分离倾向也就越大。

1.2 双水相体系的特点

双水相萃取与传统的水-有机溶剂萃取时一样的，都是利用物质在两相间的分配系数不同来实现分离的。但是与传统萃取相比，双水相有其独特之处[7～9]：(1)两相的溶剂都是水，上相和下相的含水量高达70 %～90 %(w/w)，不存在有机溶剂残留问题。条件很温和，常温常压操作，不会引起生物活性物质失活或变性；(2)两相界面张力小，仅为10-6～10-4N/m（普通体系为10-3～10-2N/m），双水相的两相差别（如密度、折射率）相差很小，萃取时两相能够高度分散，传质速度快，但也引起乳化现象；(3)溶剂对目标组分选择性强，大量杂质能与所有固体物质一同除去，使分离过程简化，易于工业放大和连续操作；(4)分相时间短，常温常压下自然分相时间一般为5～10 min；(5)目标产物的分配系数一般大于3，大部分情况下目标产物的收率较高；(6)聚合物的浓度、无机盐的种类和浓度，以及体系的pH值等多种因素都可以对被萃取物质在两相的分配产生影响，因此可以利用多种手段来使反应达到最佳条件；(7)该体系可以处理以固体微粒形式出现的样本。因其大多是由一定量的聚乙二醇和盐构成，因此也比较经济。

1.3 双水相的种类

最常见的双水相体系是聚乙二醇(PEG)/葡聚糖(Dextran) 和 PEG/无机盐（硫酸盐、磷酸盐等）体系。双水相按组成一般分为：聚合物-聚合物，聚合物-低分子量组分，聚合物-无机盐，高分子电解质-高分子电解质以及新出现的研究比较热门的温度诱导，表面活性剂等双水相体系[10～11]，详见表1。

表1 常见双水相萃取溶液体系的类型Table1 common aqueous two - phase extraction

2 双水相的萃取原理，工艺流程及其影响因素

2.1 双水相的萃取原理

双水相体系萃取分离原理与基本的液液萃取是一样的，是基于物质在双水相体系中的选择性分配。当物质进入双水相体系后，在上相和下相间进行选择性分配，这种分配关系与常规的萃取分配关系相比，表现出更大或更小的分配系数。

当物质进入双水相体系后，由于表面性质、电荷作用和各种力(如憎水键、氢键和离子键等)的存在和环境的影响，使其在上、下相中的浓度不同。其分配规律服从Nernst分配定律，即K=Ct/Cb，其中分别为上相和下相的浓度，K为分配系数。各种物质的分配系数K是不一样的，因而双水相体系对生物物质的分配具有很大的选择性。

2.2 工艺流程[12]

考虑到双水相技术用于分离纯化以及回收再利用方面，我们大概将其工艺流程分为3个方面：目的产物的萃取；PEG的循环；无机盐的循环。以分离细胞中蛋白质为例，其工艺流程图见图1。

图1 双水相萃取工艺流程图Fig.1 The technical process ofaqueous two-phase extraction

(1) 目标产物的萃取。把细胞的匀浆液倒入由PEG和(NH4)2SO4组成的双水相体系中，然后让其静置分层，等体系稳定后，蛋白质将分配到上相，即PEG相。而细胞碎片、核酸、纤维素等分配到了下相，即(NH4)2SO4相，然后把上下相分离。接着是把目标蛋白质转移到盐相，方法是在上相中加入盐，形成新的双水相体系，从而将蛋白质与PEG分离，以利于使用超滤或透析将PEG回收利用和目标产物的进一步加工处理。

(2) PEG的循环。在进行工业上大规模分离纯化操作时，要特别注意原料的回收利用，这样既有利于环保又节约了成本。PEG 的回收有两种方法：一种是加入盐使目标蛋白质转入富盐相来回收，另一种是将PEG相通过离子交换树脂，用洗脱剂先洗去PEG，再洗出蛋白质。常用的方法是将第一步萃取的PEG相或除去部分蛋白质的PEG相循环利用。

(3) 无机盐的循环。将盐相冷却，结晶，然后用离心机离心进行分离回收。其它方法有电渗析法、膜分离法回收盐类或除去PEG相的盐。

2.3 影响双水相平衡的主要因素[13～14]

影响双水相萃取平衡的主要因素有：组成双水相体系的高聚物类型、高聚物的平均分子量和分子量分布、高聚物的浓度、成相盐和非成相盐的种类、盐的离子浓度、pH值、温度等。不同聚合物的水相系统显示出不同的疏水性，聚合物的疏水性按下列次序递增：葡萄糖硫酸盐糖＜葡萄糖＜羟丙基葡聚糖＜甲基纤维素＜聚乙二醇＜聚丙三醇，这种疏水性的差异对目的产物互作用是重要的。

PEG分子量：同一聚合物的疏水性随分子量的增加而增加，这是由于分子链的长度增加，其所包含的羟基减少。两相亲水差距越大，其大小的选择性依赖于萃取过程的目的和方向。对于 PEG聚合物，若想在上相收率较高，应降低平均分子量，若想在下相收率较高，则增加平均分子量。

pH值：(1) pH值会影响蛋白质分子中可解离集团的解离程度，因而改变蛋白质所带的电荷的性质和大小，这是与蛋白质的等电点相关的；(2) pH值能改变盐的解离程度（如磷酸盐），进而改变相间电位差。

萃取温度：温度首先影响相图，在临界点附近尤为明显。但当远离临界点时，温度影响较小。大规模生产常在常温操作，但较高升温还是有利于降低体系黏度，利于分相。

无机盐浓度：盐的正、负离子在两相间分配系数不同，两相间形成电位差，从而影响带电生物大分子的分配。无机盐浓度的不同能改变两相间的电位差。

3 双水相技术在分离纯化中的应用

双水相技术作为一种生化分离技术，由于其条件温和易操作等特点，因此可调节因素较多，并且可融合传统溶剂萃取的成功经验，使其成为一种生物工程下游初步分离的方法。由于传统的的有机溶剂萃取容易使生物大分子（如蛋白质和酶）失活，在双水相发展早期，人们致力于把双水相技术应用于蛋白质等的分离纯化，从而大大降低其变性的可能性。目前，双水相萃取技术已成功应用到蛋白质、酶、核酸、氨基酸、抗生素以及生物小分子等的分离纯化。近些年来，双水相萃取技术得到很大的发展，产生了许多新型的体系，并且在天然产物，金属离子分离纯化等方面也具有广泛的应用。

3.1 在提取酶和蛋白质中的应用

这是双水相体系研究和应用最多的方面，对发酵液、细胞培养液、植物、动物组织中细胞内、外的酶和蛋白质均可提取。工业上已有几种双水相体系用于从发酵液中分离提取蛋白质和酶，绝大多数是用 PEG作上相成相聚合物，葡聚糖、盐溶液和羟甲基淀粉的其中一种作下相成相物质。

Gisela Tubio, Guillermo A等[15]利用PEG/柠檬酸钠双水相体系从牛胰腺中萃取胰蛋白酶。实验探讨从α-胰凝乳蛋白酶中分离胰蛋白酶的最佳条件，然后将其应用到从牛胰腺中分离胰蛋白酶。实验最佳条件为：PEG(w/w)-3350与柠檬酸钠组成双水相体系，在pH值为5.2时具有最佳分配性能。增加NaCl的浓度到0.7%以及减少相比到0.1时能在上相获得60%的胰蛋白酶，是纯化前的3倍。胰蛋白酶质量浓度增大到整个体系的25%(w/w)时对产率和纯化因子都没有特别大的影响。因此能证明该双水相的灵活性以及将其应用到规模生产的前景。

Sarote Nitsawang，Rajni Hatti-Kaul等[16]利用8%(w/w)的PEG及15%(w/w)的(NH4)2SO4组成的双水相体系从番木瓜乳浆中萃取木瓜蛋白酶，这种方法能在较短的时间内获得高纯度的木瓜蛋白酶并且不会破坏酶的成分，同时在分离时可以直接使用木瓜胶乳而不需要除去其它可溶性的物质，这种更快更简单以及稳定性好的方法能大规模地应用到木瓜蛋白酶的萃取当中去。

Natália Luiza Penna Dallora[17]用 PEG 和氨基甲酸铵形成的双水相萃取目标蛋白。实验研究了牛乳蛋白酶(BSA)，胰蛋白酶，溶解酶 3种蛋白质在不同质量分数 PEG(1500，4000，6000)和氨基甲酸铵形成的双水相体系中的分配行为。实验得出了3种蛋白酶在不同体系中的分配系数，牛乳蛋白酶的分配系数在 0.1～0.8，胰蛋白酶在 1.0～2.4，溶解酶在2.3～9.0之间变化。其结果与聚合物分子量及节线长度有很大的关系。从实验结果得出的各种蛋白酶的分离因子能达到较高的水平，因此此方法可以作为分离蛋白质的一种很好的下游处理方法。

Mirjana、G.Antov 等人[18]用 10%(w/w) PEG1500和20%(w/w) (NH4)2SO4作为双水相体系，萃取木聚糖酶。当酶的初级制品浓度为70%(w/w)，调节pH值在5.1的条件下，分配系数和上相产率分别达到了85.6%和97.37%，纯化因子为4.8。实验结果表明了把双水相体系作为下游过程分离纯化木聚糖酶的可行性。

Lorena、Capezio等[19]用聚乙二醇/磷酸盐双水相体系分离转基因牛奶中的乳清蛋白。研究了牛奶乳清蛋白中 4种成分牛血清白蛋白(BSA)、α-乳清蛋白(ALA)、β-乳球蛋白(BLG)、α-抗胰蛋白酶(AAT)在双水相体系中的分配行为。BSA和ALA富集在PEG相，分离系数分别达到了10.0和27.0，BLG和 AAT对磷酸盐相更具有亲和性，分离系数分别为0.07和0.01。pH值增大会使这些蛋白质的分离系数增加，然而 PEG分子量的增加使分离系数减少。使用PEG1500以及在pH值为6.3，相比R为4∶1时，对于AAT能达到最佳萃取条件，产率达到80%，纯化因子为1.5～1.8之间。

3.2 在抗生素的提取和纯化中的应用

抗生素药物通常是通过生物合成得到的，其目的产物在转化液中产率很低，且对酸、碱、有机溶剂和温度变化都比较敏感，容易变性和失活，若以常规的吸附、萃取、离子交换和沉淀等方法处理，一般萃取法一次转移并不能将杂质充分除去，须多次萃取，溶剂损失大，而且抗生素在提取过程中易变性失活而双水相技术能保证其在温和的条件下得到分离纯化。

M.M. Bora等[20]探讨了用 PEG/盐双水相体系萃取头孢类抗生素，在最佳条件：PEG-600和Na2SO4组成双水相体系，pH为8.0，PEG和Na2SO4浓度各为20%时，头孢类抗生素在双水相体系中良好的分配系数（达到了 3.5）以及疏水性都证明了该实验的可行性。

Babak Mokhtarani，Ramin Karimzadeh 等[21]用PEG、Na2SO4和 H2O组成双水相体系，萃取分离环丙沙星。实验研究了温度、盐浓度、聚合物的浓度以及分子量的大小等对实验结果的影响。实验采用矩形的星点设计-平行面法去探讨影响环丙沙星的分配行为的因素。结果表明环丙沙星分配与盐浓度有很大关系，它能明显减小环丙沙星的分配系数。聚乙二醇在低浓度时能减小环丙沙星的分配系数，然而在高浓度时能增加其分配系数，但聚合物的分子量没有明显的影响，温度对环丙沙星分配系数的影响与PEG的浓度是一样的。结果显示环丙沙星的质量浓度对抗体的分配具有相对较小的影响，同样，PEG的分子量对环丙沙星的分配行为的影响几乎可以忽略不计。实验最佳条件为：温度为10℃，PEG分子量为1500，Na2SO4和PEG的质量分数分别为9.8 wt.%和19.6wt.%。

Yangyang Jiang[22]等用PEG与[C4mim]PF6(溴化1-丁基-3-乙基咪唑)形成的离子液体双水相萃取青霉素。当达到相平衡时，青霉素的萃取率达到了95.8%。实验按萃取过程分为3个步骤：(1)在咪唑-PEG体系中加入Na2HPO4形成双水相，青霉素被萃取到富含聚合物的相，即 PEG相；(2)疏水性的离子液体[C4mim]PF6加入到上述双水相中，把咪唑-PEG从青霉素去萃取出来；(3)在离子液体中的咪唑-PEG被从[C4mim]PF6得到回收。经过这3个步骤，不仅能很好地萃取出青霉素，而且咪唑-PEG，离子液体都能得到回收，因此是一种绿色的萃取方法。

3.3 在天然产物活性成分提取的应用

当前，从天然产物中提取有效的药用成分已经受到了越来越大的关注。中草药是我国医药宝库中的瑰宝，已有数千年的历史。但由于天然植物中所含的化合物众多，特别是中草药有效成分比较难以确定及提取技术还不成熟，使得我国传统中药难以得到国际市场的认可。因此，采用具有较高选择性和专一性的双水相萃取技术对中草药有效成分的提取是一项很有意义的工作。

石慧，陈媛梅[23]利用 25%PEG-400与 12%的(NH4)2SO4双水相体系从加杨叶粗提液中萃取分离总黄酮，用紫外分光光度法直接测定总黄酮含量。试验在pH=9，NaCl的添加量为3%，粗提液3 mL，温度25℃的最佳实验条件下，加杨叶总黄酮萃取率达到了95%以上。该试验方法具有良好的精密度和选择性，为黄酮类化合物萃取分离提供了一种有效的方法。

I.-Horng Pan，Hsi-Ho Chiu等[24]把双水相萃取技术与简单乙醇处理结合起来，除去过量的无机盐，发展成从栀子花提取栀子苷。该双水相体系由PE62(一种共聚物由 20%的环氧乙烷和 80%的环氧丙烷构成)、磷酸氢二钾和乙醇构成。为探究最佳反应条件，各种可变因素包括盐浓度、聚合物浓度、样品加入量和乙醇的加入量都得到了考察。实验结果表明增加盐浓度和减少PE62浓度能够增加栀子苷在富盐相的浓度。增加乙醇以及样品加入量也能提高栀子苷在富盐相的分配效率，实验大规模萃取时最佳反应条件为：5% PE62、7.5% K2HPO4，10%乙醇。实验中由500 g栀子花能得到39 g纯度为77%的栀子苷，因此这个过程具有良好的工业应用前景。

S. Chethana，Chetan A. Nayak等[25]首次把双水相萃取作为一种下游分离过程应用到从甜菜中萃取甜菜红碱。实验考查了结线长度(TLL)、相比、相浓度、PH值、盐浓度等变量对实验结果的影响，甜菜红碱和糖分别分配到上相(PEG 相)和下相(硫酸铵相)。实验的最佳条件为：PEG-6000-(NH4)2SO4-H2O构成双水相体系，当结线长度(TLL)为 34%，相比为1.3，上相能获得70%～75%的甜菜红碱，下相能获得 80%～90%的糖。增加 NaCl浓度会使甜菜红碱的产率降低，pH为3.0时甜菜红碱的产率最高，但pH值变化对糖的产率影响不大。随后采用有机-液体萃取法把上相的PEG与甜菜红碱进行分离，能使甜菜红碱的浓度增加3.4倍。

3.4 在金属离子分离中的应用

传统的金属离子溶剂萃取方法存在着溶剂污染环境、对人体有害、运行成本高、工艺复杂等缺点。近年来，利用双水相技术萃取分离金属离子达到了较高的水平。与传统的分离工艺相比，双水相体系对贵金属以及稀有金属的分离与检测具有环境友好、废弃物少、对人体无害、运行成本低以及工艺简单等优点。

张磊，陈亮等[26]利用聚乙二醇-硫酸铵双水相体系萃取分离废弃印刷线路板处理液中的金。实验在温度为25℃，pH为1.0，PEG2000的质量分数为15%，(NH4)2SO4的质量分数为 20%的最佳萃取条件下，经过三级萃取，金萃取率达到97.56%。富集金的 PEG相无需反萃取可直接用 Zn置换出单质金，还原率达到95.16%。

张焱，亓新华等[27]利用 Cd (Ⅱ)与乙基紫( EV) 、KI缔合后，把盐析剂加入到丙醇-水双水相体系萃取分离镉。在(NH4)2SO4存在条件下，无表面活性剂EV的加入，以及加入一定酸性条件下存在的碘离子，Cd(Ⅱ)萃取率只有68%，而同样条件下，加入mg级用量的EV后，达到了完全分离。实验还考察其它如Fe(Ⅲ)，Co(Ⅱ)等离子干扰因素，结果表明了这些离子都得到完全分离。用双水相体系对 μg含量的含镉废水经过滤净化处理后可直接排放，对治理重金属镉对水的污染具有参考价值。

Vânia Goncalves Lacerda 等[28]用(EO)11(PO)16(EO)11三嵌式共聚物与硫酸锂组成双水相体系萃取分离Ni-Cd电池中的镍和镉。对这些金属在上下相产生分配影响的因素有提取剂碘化钾的加入量、结线长度(TLL)的大小、上下相的质量比、电池样品的滤出和稀释因子。当电池样品由盐酸滤出，最佳条件：62.53% (w/w) TLL，KI的浓度为 50.00 mmol·kg-1，两相质量比为0.5，样品稀释系数为35时，共聚物相Cd的产率达到了99.2%，Ni分配到盐相，产率达到90.4%。

Tianxi Zhang，Wenjun Li等[29]研究了基于聚乙二醇和盐的双水相体系萃取一价的金属氰化物Au(CN)2-。在不加萃取剂的情况下，绝大部分Au(CN)2-被萃取到PEG相，该双水相系统具有很好的萃取性能，并且pH值变化对萃取没有明显的影响。在PEG相中加入Zn，可以明显减少Au(CN)2-的含量，PEG相不会发生改变从而可以被重复利用。由于该系统的无毒和不燃性使得该方法成为了一种在碱性条件下分离金属氰化物的既干净又安全的方法。

4 双水相萃取技术展望

双水相萃取技术作为一种新型的萃取分离技术，有着很多的优点，但也存在着一定的局限性。一是成相聚合物的价格，如被普遍研究的是PEG-dextran体系，葡聚糖比较昂贵，而且体系黏度大；另外从成相聚合物中分离目标产物也比较困难,一些如超滤,电泳,色谱分离等技术成本也较高[30]。

由于常见双水相体系存在不足，及其应用越来越广泛，近些年来出现了许多新的双水相体系。(1)廉价的双水相体系，用变性淀粉、乙基羟乙基纤维素等代替昂贵的葡聚糖，用羟基纤维素、聚乙烯醇等代替 PEG，可制成廉价的双水相体系[31]。科学家也研究了用粗葡聚糖或水解的葡聚糖，但都没有取得很好的效果，Sanjoy Ghosh等[32]研究了用廉价的dextranT40代替昂贵的dextranT50。(2)温度诱导双水相体系，环氧乙烷-环氧丙烷共聚物(EO-PO)具有较低的浊点，在水溶液中，当温度超过其浊点时会形成新的两相，目标产物分配在水相，而富含EO-PO的一相得以回收。Radosław Dembczyński[33]研究用 EO50PO50与磷酸钾组成的温度诱导双水相体系从鸡蛋白中萃取出了溶解酵素。(3)去污剂形成的双水相体系，去污剂形成的胶束与高分子聚合物形成的空间结构不能相互渗透，从而导致分相，产生聚合物/去污剂两相系统。A. Rodenbrock[34]使用了农乳尔 1205清洁剂双水相萃取角质酶肽。(4)表面活性剂双水相体系，表面活性剂双水相是指正、负离子表面活性剂混合水溶液在一定浓度及混合比范围内，自发分离形成的两个互不相溶的水相。由于表面活性剂具有亲水基和亲油基的结构特点，使得这种双水相在萃取分离时具有选择性好。Punjaporn Weschayanwiwat等[35]使用阴阳离子(十烷基二苯和十二烷基三甲基溴化铵)表面活性剂双水相应用到分离废水中的苯。

双水相与相关技术的集成也成为其发展的一种趋势，如与磁场、超声波、高效层析、电泳等技术的集成，既提高了分离效率，又简化了分离流程以及提高回收等优点。

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Application of Aqueous Two-phase Extraction Technology in Separation and Purification

TAN Zhi-jian, LI Fen-fang, XING Jian-min
(College of Chemistry and Chemical Engineering, Central South University, Changsha 410083, China)

Aqueous two-phase extraction was a new fluid-fluid extraction technology. Owing to its characteristics of temperate condition, simple operation and so on, it had been widely applied to separation and purification of materials. The principle of formation, technical process and features of aqueous two-phase extraction were summarized, moreover the system category and the factors affecting its assignment performance were mentioned. Meanwhile, the practical application and forecasts, the development in the future was introduced.

aqueous two-phase extraction; separation and purification; application

TQ 028.32

A

1671-9905(2010)08-0029-07

国家自然科学基金（项目编号：20956001）

李芬芳(1964)，女，湖南邵阳人，教授，博士生导师，研究方向：植物活性成分提取及分离纯代，E-mail:lff lgg@mail.csu.edu.cn

2010-03-30