GbE抑制哮喘大鼠炎症细胞浸润的实验研究

李国豪，江庆澜，梁成结，龙幼敏，梁颜笑，雷秀霞*

（1.广州市第一人民医院，广东 广州 510180；2.广州医学院，广东 广州 510180）

支气管哮喘(Asthma，以下简称哮喘)是一种多细胞、多因子介导的具有复杂免疫机制的气道慢性炎症，以气道变应性炎症和气道高反应性为主要特征，表现为反复发作的咳嗽、喘息、胸闷或呼吸困难，是临床常见病和多发病。目前西医治疗哮喘常使用氨茶碱，能扩张支气管有效缓解症状，但副作用明显；而中医治疗哮喘远期效果较好，副作用少，尤其在治疗本病缓解期及协助西医巩固发作期疗效、降低西药副作用方面具有优势。

我国药典中记载银杏叶具有润肺、平喘、止痛等功效，用于肺虚咳嗽、冠心病和心绞痛等，我们较早前的研究已证实：银杏叶提取物(GbE)可抑制由肿瘤坏死因子α诱导的核转录因子κB(NF-κB)基因转录活性从而缓解哮喘发作[1]。本研究拟通过探讨GbE对哮喘大鼠炎症细胞数量的改变揭示其平喘作用的部分机制。

1 材料与方法

1.1 实验试剂 卵蛋白(OVA)由Sigma公司提供；银杏叶提取物即舒血宁注射液由万荣三九药业有限公司提供；氨茶碱由广州白云山明兴制药有限公司提供。

1.2 实验仪器 雅培CD3700全自动血球计数仪。

1.3 哮喘大鼠模型 体重230 g左右的清洁级雌性SD大鼠24只，由广东省医学实验动物中心提供。实验大鼠分为4组，哮喘组、氨茶碱干预组每组7只，正常对照组和银杏叶干预组每组5只。哮喘组、银杏叶干预组和氨茶碱干预组大鼠首日致敏采用腹腔内注射1 ml/只剂量的10%OVA和10%氢氧化铝混合液。时隔1周后，在第8天以相同剂量、相同方法加强致敏1次；正常对照组以等量生理盐水进行腹腔内注射。

1.4 药物干预和对照 致敏后第15天，根据大鼠体重对银杏叶(10 mg·kg-1·d-1)干预组、氨茶碱(25 mg·kg-1·d-1)组、哮喘对照组(生理盐水)和正常对照组(生理盐水)大鼠进行灌胃干预，1 h后，再以2%OVA雾化诱喘30 min，隔天1次，连续7次，共两周。

1.5 标本采集和处理 每组5只大鼠均于末次激发12 h内(哮喘组、氨茶碱干预组每组剩下的2只大鼠则于末次激发2 d和4 d后)以7%水合氯醛进行腹腔注射麻醉，解剖，从左心室取血1 ml，注入EDTA抗凝管做WBC计数用，切取部分左肺上叶以10%的福尔马林固定，HE染色做病理切片检查。

2 结果

(1)银杏叶干预组5只大鼠出现不同程度的呼吸困难、咳嗽、打喷嚏、烦躁或嘴唇发绀等症状；氨茶碱干预组7只大鼠也出现上述症状，但症状相对较轻；哮喘组7只大鼠出现呼吸急促困难、咳嗽、鼻中分泌物明显、动作不协调、乱窜或颤抖等症状；正常对照组5只大鼠一直活动正常自如，状态良好。

(2)银杏叶干预组大鼠血中WBC为(9.45±1.66)×109/L，氨茶碱干预对照组为(8.29±2.22)×109/L，哮喘组为(12.99±2.46)×109/L，正常对照组为(7.29±1.89)×109/L，经t检验银杏叶组、氨茶碱组和正常对照组三组间WBC无显著差异(P＞0.05)，但上述三组分别与哮喘组比较差异均有统计学意义(P＜0.05)，见表1。

(3)银杏叶干预组血液中EOS为(3.54±1.10)%；氨茶碱干预组为(2.26±1.64)%；哮喘组为(3.28±1.60)%；正常对照组为(1.86±1.19)%，从表1可见，4组之间比较差异均无统计学意义(P＞0.05)。

(4)观察4只于末次激发2 d内和4 d后麻醉处死的大鼠，WBC含量均较低，但氨茶碱干预组[(5.72±0.91)×109/L]的大鼠WBC仍明显低于哮喘组[(8.29±0.26)×109/L]大鼠，EOS未发现明显变化[(1.42±0.1)%和(2.31±0.37)%]。

表1 各组动物模型血液WBC、EOS结果比较（±s）

表1 各组动物模型血液WBC、EOS结果比较（±s）

注：与正常对照组比较，*P＞0.05；与哮喘组比较，#P＜0.05。

组别EOS（%）实验大鼠数量WBC（×109/L）银杏叶干预组氨茶碱干预组哮喘组正常对照组3.54±1.10*2.26±1.64*3.28±1.60*1.86±1.1955559.45±1.66*8.29±2.22*＃12.99±2.46＃7.29±1.89

(5)肺部组织病理切片结果显示，哮喘组大鼠肺支气管壁增厚，细支气管及周围炎性细胞浸润明显，成堆聚集，炎症细胞以中性粒细胞浸润为主，大量黏液形成；氨茶碱干预组及银杏叶干预组炎性细胞浸润，氨茶碱干预组稍轻于银杏叶干预组，两药物干预组上述组织学改变轻于哮喘组；正常对照组炎性细胞较少，但4组均未见嗜酸性粒细胞明显增加(见图1、图2、图3、图4)。

图1 哮喘组

图2 氨茶碱干预组

图3 银杏叶干预组

图4 正常对照组

3 讨论

支气管哮喘的本质是气道的非特异性炎症，伴有炎症细胞的浸润和氧自由基的形成。研究证实，哮喘发作时中性粒细胞被激活，形成所谓的“呼吸爆发”，产生氧自由基等引起氧化应激反应，导致细胞膜的结构和组织器官的功能损害。本研究发现使用卵蛋白诱喘实验大鼠后确实引起了大鼠气道和血液白细胞(尤其是中性粒细胞)明显增多，本组资料除正常对照组外，三个诱喘组均有不同程度的炎症细胞浸润，结果提示：银杏叶提取物和氨茶碱能降低但不能完全抑制哮喘大鼠血液和肺组织WBC浸润，与胡娜等[2]报道一致。

哮喘发作时，由于B细胞淋巴瘤因子2(Bcl-2)在EOS膜上的表达增加，患者外周血及气道内EOS均明显增多；随着病情的改善，EOS的凋亡增加，其数量又明显减少。Yasui等[3]发现氨茶碱是通过下调EOS上Bcl-2的表达来促进EOS凋亡，因此，EOS上Bcl-2的表达增加可抑制EOS凋亡。本研究未见银杏叶干预组和氨茶碱组EOS数量的明显减少，与Yasui等[3]和吴美玲等[4]报道不符。据报道，支气管哮喘时嗜酸性粒细胞可轻度增高，其含量与气道气流阻塞程度有关，在抗原作用晚期，支气管高反应性与嗜酸性粒细胞计算呈负相关[5]。由此推测，本实验结果显示嗜酸性粒细胞升降幅度与报道不相符的原因之一，可能是因为本实验从诱喘到处死大鼠整个过程持续时间过长，未找到最佳激发诱喘时间。

已有的研究证实，GbE的亲脂性物质主要成分是24%的黄酮甙和6%的萜烯，黄酮甙是有效的自由基清除剂，能够提高细胞在哮喘时对缺氧的耐受，减少自由基的生成，并保护气道细胞免遭自由基的损伤。萜烯除了能够抑制血小板激活因子（PAF）对EOS及中性粒细胞的趋化作用，减少肺组织中EOS的浸润，抑制支气管痉挛，还同时减轻PAF释放的炎症介质、毒性蛋白和酶对气道的损伤，减轻气道炎症作用[6]。本实验结果显示，氨茶碱干预组和银杏叶干预组均能降低实验大鼠血液和肺组织炎症细胞的浸润程度，证实银杏叶提取物对抑制炎症细胞浸润，缓解哮喘症状有一定的疗效。本课题下阶段的工作将着重于优化检测EOS的最佳时间并探讨银杏叶提取物平喘的部分分子生物学机制。

[1]李国豪,雷秀霞,衣艳梅,等.银杏叶提取物对核因子-κB转录通路干预作用的研究[J].中药材,2008,31(9):1357-1360.

[2]胡 娜,王 红,吕 兵,等.银杏叶提取物拮抗哮喘大鼠气道炎症的机制探讨[J].实用医学杂志,2009,25(16):2646-2648.

[3]Yasui K,Nakazawa T,Agematsu K.Theophylline accelerates human granulocyte apoptosis not via phosphodiesterase inhibition[J].JClin Invest,1997,100(7):1677-1684.

[4]吴美玲,林益平,金志华,等.银杏叶提取物对哮喘大鼠气道嗜酸性粒细胞浸润的影响[J].金华职业技术学院学报,2008,8(2):9-13.

[5]熊立凡.临床检验基础[M].北京:人民卫生出版社,2003:43-46.

[6]潘洪平.银杏叶制剂药理作用和临床应用研究进展[J].中国中药杂志,2005,30(2):93-96.