逆转录病毒介导的靶向人 Slingshot-1L基因的稳定转染细胞系的建立

张慕蕊 王 岩赵东旭 李新娜 李 群 李玉林

(吉林大学白求恩医学院病理生物学教育部重点实验室,吉林 长春 130021)

逆转录病毒介导的靶向人 Slingshot-1L基因的稳定转染细胞系的建立

张慕蕊 王 岩1赵东旭 李新娜 李 群 李玉林

(吉林大学白求恩医学院病理生物学教育部重点实验室,吉林 长春 130021)

目的 应用 Slingshot(SSH)-1L重组逆转录病毒载体,建立过表达该基因的稳定转染细胞系。方法 用脂质体法将含 SSH-1L的重组逆转录病毒载体pLNCX-SSH-1L转染 PA 317包装细胞,G418筛选,滴度测定。收集病毒上清感染MG63细胞,G418筛选。结果 应用 pLNCXSlingshot-1L重组逆转录病毒载体,获得滴度为5×108CFU/L的病毒上清,感染MG63细胞,获得了过表达 SSH-1L基因的MG63细胞。结论 应用SSH-1L重组逆转录病毒载体,成功建立了过表达该基因的稳定细胞系。

逆转录病毒;稳定转染

细胞骨架蛋白家族成员肌动蛋白(actin)通过解聚、重聚的动态变化,在肿瘤转移中发挥重要作用。肌动蛋白解聚因子(Cofilin)是丝切因子家族的一员,主要功能是增强 actin活力,参与调控细胞的移动〔1〕。Slingshot(SSH)是一种特异的 Cofilin磷酸酶,可使 Cofilin去磷酸化而活化,进而抑制 actin丝聚合,对细胞迁移至关重要〔2〕。目前国内外对 SSH的研究才刚刚开始。本文应用 SSH-1L重组逆转录病毒载体获得高滴度的病毒上清,建立过表达该基因的稳定转染细胞系,为研究肿瘤转移的相关机制奠定实验基础。

1 材料与方法

1.1 材料 MG63、PA 317及N IH3T3细胞为本实验室保存。重组逆转录病毒载体 pLNCX-SSH-1L由王岩教授惠赠(SSH-1L基因全长插入逆转录病毒载体 pLNCXMCS多克隆位点,末端含有 c-m yc tag)。脂质体 2000购自 Invitrogen公司,高糖DM EM培养基购自美国 Gibco公司,胎牛血清购自 Hyc lone公司,胰蛋白酶和 EDTA购自 Sigm a公司,免疫组织化学试剂盒购自福州迈新公司。抗人 c-m yc tag抗体购自博奥森生物工程有限公司,抗人 P-cofilin抗体、抗人 Cofilin抗体购自美国 SantaCruz公司。引物 hSSH-1L前向:CACAAGCATGCAGGTGATCT,反向:TATGTGCATCCTTCCTGCTG(306 bp);GAPDH前向: GCATCCTCACCCTGAAGTAC,反向:TGGTGCCGCCAGACAGCACT(750 bp)由上海生工合成。

1.2 病毒包装及阳性克隆筛选 将 PA 317细胞接种于 6孔板中,至细胞长满约 80%时用脂质体法将 pLNCX-SSH-1L重组质粒转入 PA 317细胞,参考 Invitrogen公司试剂盒说明书操作。转染 48 h后以 1∶8传代,然后用含 800m g/L G418和 10%胎牛血清的 H-DM EM培养基筛选。10 d后可见阳性克隆,挑选克隆,继续培养,待细胞接近完全融合时移取上清,即含有病毒的培养液。以未转染的 PA 317细胞作对照。

1.3 计算病毒滴度 将 N IH 3T3细胞以 1×105细胞/孔接种于 6孔板中。收集病毒液,经醋酸纤维素膜滤器过滤后,制备 6个系列稀释梯度的病毒液,加入 6孔板,Po lybrene终浓度为8μg/m l。病毒感染 24 h后,用含 500μg/m l G418培养液筛选1 w。计算公式如下:病毒滴度 =最高稀释度形成的克隆数 ×稀释因子。

1.4 稳定转染细胞系的建立 将MG63细胞以 1×105细胞/孔接种于 6孔板中,从包装细胞 PA 317收集的病毒液,经醋酸纤维素膜滤器过滤后,将病毒液加至MG63细胞,间隔 24 h后可再次感染病毒,Po lybrene的终浓度为 8μg/m l。24 h后更换含 500μg/m l G418培养液筛选,2 w后获得阳性克隆,随机挑选阳性克隆扩增培养,G418浓度降为 200μg/m l。

1.5 稳定转染细胞系的鉴定

1.5.1 用抗人 c-m yc tag抗体对转染后的细胞进行免疫荧光测定 转染和未转染的MG63细胞铺细胞爬片,待爬片上的细胞长满 80%时用 PBS冲洗,4%多聚甲醛室温固定 30m in,PBS冲洗,加过氧化物酶阻断剂,血清封闭,加一抗 (抗人 c-m yc tag抗体),4℃孵育过夜,PBS冲洗,加 FITC标记的二抗,避光孵育,PI染核。胞浆中出现绿色荧光为阳性反应。

1.5.2 应用 RT-PCR检测 SSH-1L的表达情况 提取转染和未转染MG63细胞的总 RNA,测定纯度及含量,反转录合成cDNA (RT),PCR扩增,SSH-1L反应条件为 94℃ 2 m in, 94℃1m in、60℃ 30 s、72℃ 30 s 33个循环,72℃ 7 m in, 4℃10m in,GAPDH反应条件为 95℃2m in、95℃30 s、55℃30 s、72℃30 s28个循环,72℃10m in,4℃10m in,反应结束后,取 PCR产物5μl,经琼脂糖凝胶电泳后,紫外灯下观察,照相记录结果。

1.5.3 W estern印迹检测 Cofilin和 P-cofilin的表达情况 裂解细胞,离心取上清加入凝胶加样缓冲液,沸水浴上加热5m in,上样量为 20μl,电泳、转膜、杂交、ECL显色。

2 结 果

2.1 pLNCX-SSH-1L转染包装细胞 PA 317 转染后第 5天可见 PA 317细胞大批死亡,第 7天阴性对照组全部死亡,第 10天实验组出现由数个细胞组成的阳性克隆(图 1),2 w左右阳性克隆接近融合。

2.2 病毒液的产生及病毒滴度的测定 待阳性克隆接近融合,收集 PA 317细胞的病毒上清,感染N IH3T3细胞 24 h后,用含 500μg/m l G418培养液筛选 1 w,测定病毒滴度为 5×108CFU/L。

2.3 稳定转染细胞系的建立 收集病毒上清,感染M G63细胞。经 500μg/m lG418培养液筛选 2 w后,获得 18个阳性细胞克隆,随机挑选 5个阳性克隆扩增培养,G418浓度降至200μg/m l(图 2)。

图1 pLNCX-SSH-1L转染包装细胞PA 317,获得阳性克隆(×100)

图2 获得M G63细胞稳定转染阳性细胞克隆

2.4 稳定转染细胞系的鉴定 用 c-m yc tag抗体对转染后的细胞进行免疫荧光测定,结果显示MG63细胞感染率为 90%以上(图3)。应用RT-PCR检测 SSH-1L的表达情况,结果显示转染组较未转染组 SSH-1L的表达明显增强 (图 4)。W estern印迹结果显示转染组较未转染组,P-cofilin的表达明显减少 (图5),证实过表达 SSH-1L的稳定转染细胞系建立成功。

图 3 免疫荧光检测M G63细胞的感染率(×100)

图4 RT-PCR检测SSH-1L的表达情况

图5 W estern印迹检测结果

3 讨 论

癌细胞可侵入邻近组织和血管,最终导致转移。细胞的移动始与膜突触的形成,而膜突触形成的驱动力取决于膜上肌动蛋白丝的聚合,还需要一些与之结合的调节蛋白参与〔3〕。迄今为止,已经发现多种 actin结合蛋白,其中 Cofilin被认为有着关键作用〔4,5〕。目前研究证明,Cofilin是 L IM激酶及 SSH磷酸酶在细胞内惟一已知的底物。SSH由 3种基因编码,每种都有长型和短型(长型以L表示)。3个 SSH家族磷酸酶在亚细胞分布、与肌动蛋白丝的结合活性、特异活性和组织表达方式上有所不同,SSH-1L和 SSH-2L与肌动蛋白丝紧密结合并共存。SSH-1L,连同 SSH-2L和 SSH-3L使 Cofilin去磷酸化,从而激活Cofilin,进而促进肌动蛋白丝的解聚,抑制肌动蛋白丝聚合,因而对细胞定向移动至关重要〔6～8〕。

逆转录病毒基因结构简单、易于操作,感染效率高,应用范围广,是目前用于体内外研究最有效的基因转移系统之一〔9〕。逆转录病毒重组载体pLNCX有复制缺陷性,没有感染能力,必须经过包装细胞的包装。当逆转录病毒载体转染包装细胞PA 317细胞后,形成只有一次感染能力的病毒颗粒。并且PA 317细胞的病毒结构需要与载体进行 2次以上同源重组才可能产生野生型病毒,因而安全性较高;此外 PA 317细胞是嗜双性的,包装效率也高。因此,PA 317细胞已经被广泛运用于基础研究及临床试验。笔者将 pLNCX-SSH-1L转染 PA 317细胞后,获得滴度为 5×108CFU/L的病毒上清,再用其感染骨肉瘤细胞系MG63细胞,共收集 18个克隆,随机挑选 1、3、5号克隆扩增培养,经 RT-PCR和W estern印迹结果证实转染成功,免疫细胞化学测定M G63细胞感染率为 90%以上。这为研究SSH在肿瘤转移的相关机制方面奠定了实验基础。

1 Pavlov D,M uhlrad A.A ctin filament severing by cofilin〔J〕.JMolB iol,

2007;365(5):1350-8.

2 W ang Y,Shibasaki F,M izuno K.Calcium signal-induced cofilin dephosphorylation ism ediated by slingshot via calcineurin〔J〕.J B io l Chem,

2005;280(13):12683-9.

3 Yam aguchiH,Condeelis J.Regu lation of the actin cyto skeleton in cancer cellm igration and invasion〔J〕.B iochim B iophysA cta,2007;1773(5):

642-52.

4 Pavlov D,M uh lrad A.A ctin filam ent severing by cofilin〔J〕.JM o lB io l,

2007;365(5):1350-8.

5 Huang TY,DerM ardirossian C.Cofilin phosphatasesand regu lation of actin dynam ics〔J〕.CurrOp in CellB io l,2006;18(1):26-31.

6 Ohta Y,Kousaka K,Nagata-Ohashi K,et al.D ifferential activity,distribution and tissue exp ression patternsof threemembersof Slingshot fam ily phosphatases thatdephosphorylate cofilin〔J〕.GenesCells,2003;8(1):11-24.

7 N ishitaM,W ang Y,Tom izawa C,et a l.Phosphoinositide 3-kinase-mediated activation of cofilin phosphatase Slingshotand its role for insu lin-inducedmembrane p rotrusion〔J〕.JB iolChem,2004;279:7193-8.

8 Huang TY,DerM ardirossian C.Cofilin phosphatases and regulation of actin dynam ics〔J〕.CurrOp in CellB iol,2006;18(1):26-31.

9 W ilson DR.V iralmediated gene transfer for cancer treatment〔J〕.Curr Pharm B iotechnol,2002;3(2):151-6.

〔2009-12-15收稿 2010-01-10修回〕

(编辑 曲 莉)

Estab lishm en t of stab le tran sfected cell line Slingshot-1L m ed ia ted by retrov ira l

ZHANGM u-Ru i,W ANG Yan,ZHAO Dong-Xu,et a l.

Key Labora tory of Pa thob io logy,M in istry of Educa tion,Schoo l of BasicM ed ica l Sc iences,Jilin Un iversity,Changchun 130021, Jilin,Ch ina

O b jective To estab lish stable transfected cell line by retroviral vector encoding Slingshot-1L.M ethods The p lasm id pLNCX-Slingshot-1L was transfected into packaging cell PA 317 by lipofectam ine.The transfectantswere selected by G418 and viral titers were analyzed.V irals supernatantwere co llected to infectMG63 sells,selected by G418.Resu lts V irals supernatantw ith high viral titers were obtained by retroviral vecto r encoding Slingsho t-1L.V irals supernatan twere co llected to infectM G63 sells,and the stab le transfected MG63 cell linewas estab lished.Conc lusion s The stab le transfected cell line over-exp ression Slingshot-1L m ediated by retroviral is established successfully.

Retrovirus vector;Stab le transfected cell line

book=492,ebook=26

Q782

A

1005-9202(2010)04-0492-03

国家863重大专项资助项目(2004AA 205020);国家自然科学基金资助项目 (30772488);吉林省科技厅重大项目(20076023)

1 吉林大学中日联谊医院临床基因诊疗中心

李玉林(1950-),男,教授,博士生导师,主要从事干细胞组织工程方面的相关研究。

张慕蕊(1981-),女,博士,主要从事细胞信号转导的相关研究。