通过母血中胎儿表观遗传学标记物预测子痫前期的探讨

刘润花，王 健，武永明，郭俊成，穆雅琴，赵富玺*

(1.山西大同大学医学院，山西大同 037009；2.山西大同大学免疫研究所，山西大同 037009）

通过母血中胎儿表观遗传学标记物预测子痫前期的探讨

刘润花1，王 健2，武永明1，郭俊成2，穆雅琴2，赵富玺2*

(1.山西大同大学医学院，山西大同 037009；2.山西大同大学免疫研究所，山西大同 037009）

目的通过实时荧光定量PCR法测定孕妇血浆中胎儿表观遗传学标记物非甲基化丝氨酸蛋白酶抑制剂B5(un-methylated serpin peptidase inhibitor，clade B，member 5，U-maspin)基因的含量，初步探讨母血浆中U-maspin基因的定量能否预测子痫的发生.方法随机选择子痫前期孕妇40例为实验组，其中轻度和重度患者各20例，以健康同期妊娠妇女20例为对照组.提取血浆游离DNA，用甲基化特异性PCR(MSP)方法检测各组血浆标本中U-maspin基因的含量.结果子痫前期组孕妇血浆中U-maspin的水平高于对照组，差异有统计学意义 (P＜0.05)，轻、重度子痫前期患者平均浓度有差异，分别为1 402.05 copies/mL及2 189.60 copies/mL(P＜0.05).结论U-maspin基因作为孕妇血浆中游离的胎儿特异性表观遗传学标记物，可以预测子痫的发生.

孕妇血浆 非甲基化maspin 荧光定量PCR 产前诊断 子痫前期

子痫前期是妊娠期特有疾病，是孕产妇和围产儿发病及死亡的主要原因之一.以往的研究通过检测Y染色体特异性序列和父源性的基因多态性位点，证明了游离胎儿DNA在子痫前期孕妇血浆中异常增加，这种变化与病情的严重程度密切相关[1].但是，这种方法受到了胎儿性别和基因多态性的局限.目前，有研究者应用表观遗传学方法，利用母亲和胎儿DNA甲基化的差异性，在孕妇体内检测到了一种特异的表观遗传标志物U-maspin[2]，突破了在母血中检测游离胎儿DNA的局限性.本研究将表观遗传学方法用于测定子痫前期孕妇血浆中游离胎儿DNA的含量变化，为非创伤性产前诊断提供新的思路.

1 资料与方法

1.1 对象

选择2008年7月-2009年5月在山西大同第一、三、五人民医院就诊、定期产前检查妊娠26～41周的孕妇60例，其中子痫前期患者40例又区分出轻度、重度各20例为实验组，年龄27～40岁，平均孕周32±3.6周，健康晚期妊娠妇女20例为对照组，年龄26～39岁，平均孕周32±2.5周，两组孕妇年龄、孕周比较，差异均无统计学意义 (P＞0.05).分别签署知情同意书.

1.2 方法

1.2.1 样本的制备

抽取孕妇外周血4mL置于乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝管中，2 000 r/min离心10min，吸取上清置于灭菌的EP管中，13 000 r/min离心5 min，吸取上层血浆，分装于1.8mL的冻存管中，-80℃冰箱保存备用.

1.2.2 血浆中游离DNA的提取

取待检血浆1.2mL，应用QIAamp Blood Kit(Qiagen，德国)，根据其操作手册提取DNA，最后每份DNA标本用50μLBuffer AE洗脱，-20℃冰箱保存.

1.2.3 引物、探针的设计与合成

U-maspin引物为 F：5’-TTTTATTTT ATT GAATATTTTATTTT TTGGTTTCGT-3’，R：5’-AAAAAAAACTATAAATTACATACATA CATACAAACATGCA-3’，探针：5’-FAM-TGGGTTGAGAGGATTGT-MGB-3’，由上海生工生物工程公司合成.

1.2.4 甲基化特异性 PCR (methylation-specific PCR，MSP)

用Chemicon公司CpGenomeTM DNA Modification Kit进行DNA亚硫酸氢盐转化，均按说明书操作.采用FTC-2000实时荧光定量PCR仪(Funglyn Biotech公司，加拿大)，扩增U-maspin基因.反应体系：取模板DNA 20μL，Premix Ex TaqTM 25 μL(TaKaRa提供)，10μM引物各1.5μL，10μM TaqMan探针1μL，加双蒸水至总体积50μL.反应条件：95℃，3 min；40个循环 (94℃20 s，60℃20 s，72℃30 s)；每个循环结束时PCR仪自动检测一次荧光值.利用已知浓度含目的基因的质粒标准品(上海生工提供)绘制标准曲线.为了实验的准确性，减少污染，在实时定量PCR扩增系统中同时做阴性对照及空白(三蒸水)对照.记录U-maspin的CT值(每个反应管内的荧光信号到达设定的荧光阈值时所经历的循环数)，通过标准曲线得到其靶定量值.采用如下的方程进行计算：C＝Q×VDNA/ VPCR×Vext，C＝血浆中目的基因的靶浓度(copies/ml)，Q＝PCR检测到的靶定量值 (copies)；VDNA＝提取后得到的DNA模板总量；VPCR＝进行PCR的血浆模板量；Vext＝提取出的血浆总量.

1.3 统计学方法

应用SPSS 13.0统计软件进行统计分析，三组样本均服从正态分布 (P＞0.05)，所有计量资料值以 χ±s表示，经方差齐性分析(P＜0.05)，多样本间均数比较采用 K ruskal-Wallis检验，采用Bonferroni法进行样本间的多重比较.P＝0.05为检验标准.

2 结果

2.1 各组中U-maspin基因的检出率

60例孕妇血浆中均检测到了U-maspin基因，检出率为100%，如图1.

图1 U-maspin基因的扩增曲线

2.2 孕妇血浆中U-maspin基因的定量分析

三组孕妇血浆中U-maspin基因含量比较，差异存在显著性 (P＜0.01，表1、图2).子痫前期组血浆中U-maspin基因浓度明显高于正常晚期妊娠组(P＜0.01).重度子痫前期患者血浆中该基因含量的平均水平是轻度子痫前期患者的1.56倍，见表1.

表1 三组孕妇血浆中U-maspin基因的浓度

图2 三组孕妇血浆中U-maspin基因浓度的比较

3 讨论

3.1 孕妇血浆中的游离胎儿DNA

传统的获取胎儿遗传信息进行产前诊断的方法如羊膜腔穿刺术、绒毛膜取样、脐带取血等均具有创伤性，有的甚至造成孕妇的感染、流产.1997年，Lo等发现在孕妇的外周血中存在着游离胎儿DNA，这为非侵入性产前诊断提供了新的途径.测定母血中游离胎儿DNA对诊断、治疗、预测这些疾病预后有重要意义：①检测母血中胎儿Y染色体序列以诊断X连锁显性或隐性疾病[3];②通过相对染色体剂量的方法产前诊断21三体综合征[4];③通过父源突变体预测遗传病[5];④应用血清中游离DNA检测胎儿RhD基因型，准确率高达100%[6];⑤在早产[7]、子痫前期[8]孕妇血清中游离胎儿DNA的含量异常高于正常孕妇血清中的含量，且临床症状越重升高越明显.然而，由于孕妇外周血中游离胎儿DNA只占母血总游离DNA的3%-6%[9]，有效地提取胎儿DNA尤为重要.本实验通过两步离心法提取血浆，确保血细胞完全清除.使用QIAamp Blood Mini Kit提取DNA，通过加大血浆的投入总量来增加微量目的基因的浓度;为了防止蛋白、盐分等污染，用试剂盒中的bufferAW1、bufferAW2反复洗脱;为保证最终模板DNA的浓度，将洗脱后的TE液再次入柱离心;用荧光定量PCR检测对母体血浆中U-maspin基因绝对定量，Lo[9]等证实这种检测技术灵敏到足以检测出一个拷贝的基因量，准确率几乎达到100%.

3.2 表观遗传学方法在非创伤性产前诊断中的应用

目前，大量的应用研究都是通过Y染色体特异的序列SRY、DYS14[3]提取孕妇外周血中胎儿DNA，然而这些序列的诊断仅适用于50%的怀男性胎儿的孕妇.后有大量的研究集中在短串联重复序列(STRs)[10]和单核苷酸多态性(SNPs)上，但明显增加了实验的复杂性，也不利于临床应用.关于孕妇外周血中胎儿mRNA的研究还尚不成熟.应用表观遗传学DNA甲基化技术，从母亲和胎儿DNA甲基化的差异性上突破母血中检测胎儿DNA技术的局限性，取得了新进展.Chim等[2]研究证实，maspin基因在胎盘细胞中处于非甲基化状态，而在母血细胞中处于高甲基化状态，非甲基化的maspin序列中存在胎儿SNP基因型，可以作为不受胎儿性别和遗传多态性影响的通用标记物.这就提供了一种将母体循环游离胎儿DNA检测用于临床的工具，代表着非创伤性产前诊断从过去的研究向前迈进了一大步.本实验表明在60例孕妇中均检测到了U-maspin基因，检出率为100%.

3.3 孕妇血浆中胎儿游离DNA定量在子痫前期预测中的意义

妊娠期高血压疾病在妊娠中发生率大约为5%～10%[11]，严重影响母婴健康，目前其确切病因未明，因此，提高该病的预防与预测就显得格外重要.目前较普遍的预测方法如平均动脉压、翻身试验、血液流变学试验、尿钙排泄量测定等以及某些生化学方法的预测虽有着一定的提示作用，但均非胎儿所特有的标志物.近年来，大量的研究[12]证明了由于子痫前期孕妇胎盘及其血管内皮的损害，使血浆中存在大量的游离DNA，其中胎源性DNA量明显高于正常妊娠组.本研究检测了子痫前期孕妇血浆中U-maspin基因的含量，平均浓度为1 795.83 copies/mL.与相同孕周的正常孕妇相比，胎儿DNA上升了4.06倍.表明孕妇外周血中U-maspin基因浓度的异常变化是预测子痫前期的一个重要指标.本实验进一步分析了轻、重度子痫前期中U-maspin基因含量的差异，证实了这种游离胎儿标记物与子痫前期的严重程度密切相关，可以提示子痫前期-子痫的发生及预后.

本研究证实了孕妇血浆中U-maspin基因可以作为一种非性别和基因多态性依赖的胎儿特异性标记物应用于子痫前期的产前诊断中.尚需进一步大样本的前瞻性研究，并可望能在子痫前期临床症状发生前即可检测到胎儿DNA的异常升高.

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The Approach of the Quantitative Analysis of Fetal Epigenetic Signature in M aternal Plasma in Pre-eclam psia

LIU Run-hua1，WANG Jian2，WU Yong-ming1，GUO Jun-cheng2，MU Ya-qin2，ZHAO Fu-xi2
(1.Medical School of ShanxiDatong University,Datong Shanxi,037009；2.Research Institute of Immunology，Shanxi Datong University，Datong Shanxi，037009)

Objective Apply Fluorescence quantitative polymerase chain reaction (FQ-PCR)to quantify un-methylated serpin peptidase inhibitor，clade B(un-methylated maspin)gene in maternal plasma，and to study if it can be used to predict eclampsia.Methods Forty pre-eclamptic pregnantwomen includingmild pre-eclampsia(20 cases)and severe pre-eclampsia(20 cases)were selected as study guoup，twenty gestational age-matched normal pregnancieswere selected as control group.Free DNA of plasma sampleswas extracted，Themethylation-specific PCR (MSP)method was used to detect the expression of U-maspin gene.Results The level of fetal DNA in preeclampsia was higher than thatof controls(P＜0.05).Therewas significant difference betweenmild and severe pre-eclampsia subjects，Themean concentrationswere 1 402.05 copies/mL and 2189.60copies/mL(P＜0.05)respectively.Conclusion U-maspin genemay be considered as a epigenetic marker to detect the fetal DNA in maternal plasma，and itmaybe helpful to predicteclampsia.

maternal plasma；un-methylated maspin；fluorescence quantitative PCR；prenatal diagnosis；pre-eclampsia

R714

A

〔编辑 杨德兵〕

1674-0874(2010)02-0044-04

2009-09-15

国家人口计生委资助项目[2005]11号C1-41；山西省科技厅攻关项目[NO.20080311072]

刘润花(1957-)，女，山西朔州人，实验师,研究方向:遗传与免疫学.*赵富玺,教授,硕士生导师,通信作者.