格列卫对恶性淋巴瘤细胞Raji凋亡和增殖的实验研究

马 莉，马梁明

(山西大同大学医学院，山西大同 037009）

格列卫对恶性淋巴瘤细胞Raji凋亡和增殖的实验研究

马 莉，马梁明

(山西大同大学医学院，山西大同 037009）

目的研究不同浓度格列卫对恶性淋巴瘤细胞株Raji细胞的影响.方法采用MTT法检测不同浓度格列卫对Raji细胞在不同时间的生长抑制作用，应用流式细胞术检测药物对Raji细胞Caspase-3的表达及G1期、S期占整个细胞周期的比例，采用免疫组化SABC法检测药物对Raji细胞P16蛋白的表达.结果格列卫使细胞存活率明显下降(P＜0.05)；未能上调Caspase-3表达(P＞0.05)；无明显诱导凋亡作用(P＞0.05)；格列卫在低浓度72 h与高浓度48 h、72 h时P16蛋白表达与对照组相比有显著差异(P＜0.05)；格列卫对Raji细胞G1期、S期所占细胞周期的比例与对照组相比无显著差异 (P＞0.05).结论STI571在高浓度时可以上调Raji细胞P16蛋白的表达；STI571对恶性淋巴瘤细胞株Raji细胞无上调Caspase-3表达及影响细胞周期的作用.

亚砷酸 格列卫 淋巴瘤 Caspase-3 P16 细胞周期

淋巴瘤治疗通常以联合化疗及放疗为主，对于难治及晚期患者可通过造血干细胞移植进行治疗，虽然预后有一定的改善，但仍有部分患者达不到完全缓解或缓解后复发，这就迫使我们去改进对淋巴瘤的治疗方法.近年来国内外学者用人类第一分子靶向药物——基因产物格列卫(STI571)治疗慢性髓性白血病获得可喜成就.但其在淋巴瘤的研究尚属实验阶段，国外文献报道[1]格列卫对部分表达c-kit受体的淋巴瘤有作用，但在淋巴瘤中的抗肿瘤作用还未明确.本课题将此药对淋巴瘤细胞株Raji增殖及凋亡作一研究，从而为临床研究淋巴瘤提供实验依据.

1 材料

Raji细胞株 (中科院上海生物细胞库)，STI571 (瑞士诺华公司中国分公司)，RPMIl640培养基 (美国GIBCO公司)，胎牛血清 (杭州四季青生物制品厂)，SABC检测试剂盒 (武汉博士德生物制品有限公司),Caspase-3鼠抗人单抗IgG (郑州生物制品厂)，P16小鼠抗人单抗IgG(北京中杉公司)，MTT( Sigma公司)，HEPES(北京夏斯生物技术有限公司).

2 方法

2.1 药物配置

STI571用三蒸水配成5.0mmol/L，使用浓度为0.0、10.0和25.0μmol/L.

2.2 细胞培养

将 Raji细胞培养在含 10% 胎牛血清 RPMI1640培养液中，在37℃恒温、体积分数为5% CO2条件下培养24 h，换液一次，取对数生长期细胞分别加入不同浓度 STI571(0.0、10.0和 25.0 μmol/L)不同时间(24、48和72 h)收获.以未加药同期培养的细胞作为阴性对照.

2.3 采用噻唑蓝(MTT)还原法检测药物对细胞的

抑制率

取96孔培养板，每孔加入药物处理后的细胞悬液200μL，每种药物浓度为一组，每组设8个平行孔，培养不同的时间.然后每孔加入MTT(5mg/mL) 20μL，37℃继续培养4～6 h后，弃上清液，加二甲基亚枫(DMSO)150μL，显微镜下观察着色颗粒消失后，选择490 nm为测试波长，在(MTT)自动酶标仪上测定各孔吸光度OD值.抑制率计算公式为：

细胞生长抑制率＝(1-实验组OD值/对照组OD值)×100%.

2.4 流式细胞仪检测Caspase-3的表达率

将不同浓度药物处理不同时间后的Raji细胞调至1x106/mL，收集细胞悬液，标记，清洗，离心，弃上清液.分别加入1%FACS液500μL，破膜，离心弃

2.5 免疫组化观察P16的表达

将药物处理后细胞制成细胞涂片,采用SABC法，免疫组化染色步骤按试剂盒提供的程序进行.Raji细胞P16蛋白阳性评判标准：凡细胞核或(和)胞浆中出现明显的棕色或棕黄色染色为阳性反应细胞.每组选择高倍镜下10个有代表性的视野，放大倍数为40×10，用BX51型Olympus光学显微镜结合BI-2000数码显微医学图像分析系统对玻片进行图像分析，以平均光密度值对其中的阳性染色进行分析.

2.6 流式细胞仪检测细胞周期

将不同浓度药物处理不同时间后的Raji细胞调至1x106/mL，收集细胞悬液离心、去上清，加入75%冰乙醇打匀固定，4℃过夜，离心、去上清，PBS洗涤1次，加入含Triton-X-100、枸橼酸纳、5mg/mL碘化丙啶(PI)的染液0.5mL染色，用流式细胞仪作细胞周期分析.

2.7 统计学方法

采用 SPSS13.0软件进行统计学处理，以P＜0.05为有统计学意义，MTT、Caspase-3及免疫组化的实验结果用两因素三水平析因设计，细胞周期结果用方差分析进行设计.

3 结果

3.1 MTT法分析药物对Raji细胞的生长抑制率

STI571与空白对照组相比差异有显著性 (P＜0.05），使细胞存活率明显下降(见表1).

表1 药物对Raji细胞生长抑制率(MTT法)(n=3)/%

3.2 流式细胞仪进行Caspase-3含量的测定

Raji细胞经不同浓度 STI571作用不同时间后，凋亡率未发生明显变化(P＞0.05)，STI571对Raji细胞无明显诱导凋亡的作用(见表2).

表2 Caspase-3检测结果(n=3)/%

3.3 免疫组化分析P16的表达

STI571在10.0μmol/L 72 h与25.0μmol/L 48 h、72 h时P16蛋白平均光密度值与对照组相比有显著差异(P＜0.05).

表3 P16蛋白光密度检测结果(n=3)

3.4 流式细胞仪进行细胞周期DNA含量的测定

STI571对Raji细胞 G1期、S期占细胞周期的比例无明显影响(P＞0.05).

表4 流式细胞仪测定细胞周期比例结果(n=3)/%

4 讨论

淋巴瘤是一组原发于淋巴-网状组织的恶性克隆性疾病，虽然其对各种化疗敏感，但易复发，易产生耐药，病情迁延不愈，预后较差.STI571，商品名为格列卫 (Gleevec)，化学名为4-[(4-甲基-4-哌嗪)甲基]-N-[4-甲基-3-{[4-(吡啶)-2-嘧啶]氨基}苯基]-苯胺甲磺酸盐，属于2-苯氨基嘧啶的衍生物.最初STI571是针对慢性粒细胞白血病(CML)的分子起因设计的，是第一个用于临床治疗恶性肿瘤的细胞信号传导抑制剂.研究发现，STI571通过与ATP竞争性结合酪氨酸激酶催化部位的核苷酸结合位点，使得底物的酪氨酸残基不能被磷酸化，从而导致细胞增殖受抑，诱导细胞凋亡.

实验中，应用MTT还原法检测药物对细胞抑制率的时候发现STI571对细胞的生长都有一定的抑制作用，其抑制活性呈剂量和时间依赖性.

细胞内半胱氨酸蛋白水解酶Caspase家族成员的瀑布式激活反应是凋亡过程中的一个重要事件.现在认为Caspase-3是细胞凋亡过程中最主要的终末剪切酶.研究结果显示[2]，STI571引起K562细胞凋亡时检测到了Caspase-3的相对分子质量为20× l03亚单位，因为Caspase-3水解后相对分子质量就是约为 10×l03及 20×103的亚单位，所以 STI571引起K562细胞凋亡需要Caspase-3的参与，但国外文献报道 STI571对骨髓瘤细胞作用不是通过Caspase-3途径[3].为证实STI571是否可通过激活Caspase-3诱导淋巴瘤细胞的凋亡，实验中选用10.0μmol/L和25.0μmol/L的STI571作用淋巴瘤细胞株Raji细胞，结果显示，细胞Caspase-3活性未发生明显上调，与对照组相比无统计学意义 (P＞0.05).因此，实验结果显示 STI571并不能通过Ccaspase-3途径来诱导Raji细胞凋亡.

c-kit受体分布于细胞表面，是干细胞因子(Stem cell factor，SCF)受体，属于膜受体，是III型酪氨酸蛋白激酶受体，参与细胞的增殖、凋亡和分化.STI571能阻断c-kit基因产物，抑制酪氨酸激酶活化，阻断活化胞浆内的转录因子，从而诱导细胞凋亡、抑制细胞增殖、提高细胞分化.对于非霍奇金淋巴瘤c-kit受体表达国外研究认为，非霍奇金淋巴瘤细胞表面c-kit受体多数呈部分表达，部分缺失.Aldinucci D[4]研究显示CD30+淋巴瘤上有c-kit受体表达，Rassidakis GZ[1]等同样以CD30+的霍奇金细胞和间变型大细胞淋巴瘤细胞为研究对象，通过RT-PCRm、Western blot及流式细胞术发现在这些细胞上均未检测到 c-kit的mRNA和蛋白表达，认为c-kit受体在这些瘤细胞上表达很稀少，而将STI571应用于这些细胞后发现STI571对瘤细胞亦无明显抑制作用，所以认为STI571对这些淋巴瘤无效.Brauns T[5]等人研究发现在各型原始皮肤T细胞淋巴瘤上很少有c-kit受体的表达.我们研究结果显示，随STI571浓度增加，Caspase-3含量逐渐增加，虽然与对照组比较无明显统计学差异，但提示剂量与其有关，且在同一浓度下，随时间的延长，Caspase-3含量也有增加趋势，虽然无统计学差异，但也提示时间与其有关，所以我们认为 STI571对 Raji细胞主要作用不是启动胞内Caspase-3途径诱导淋巴瘤细胞凋亡.这可能是因为细胞膜表面的c-kit受体表达较少，如果是采用大剂量STI571是否可以启动 Caspase-3途径则有待于进一步实验研究.

细胞增殖周期异常与肿瘤细胞的恶性增殖密切相关，实验中应用流式细胞仪检测细胞周期发现，未加药组瘤细胞基本处在S期，且多为超二倍体，应用STI571后，各期细胞所含的数目与未加药组相比无明显改变，不同浓度的STI571对Raji细胞的细胞周期无明显影响，也未出现细胞凋亡峰，其可能原因是c-kit受体表达较少，难以启动胞内Caspase-3途径，也进一步证实了 STI571对Raji细胞无凋亡作用.

P16蛋白又称多肿瘤抑制基因1(Multiple tumor suppressor 1，MTS-1)，对细胞周期G1期有特异性调节作用[6].当P16基因突变、缺失时，将刺激细胞分裂向癌变发展.国内外文献报道[7-8]，在恶性淋巴瘤细胞中P16基因表达异常[9-10]，P16蛋白表达与非霍奇金淋巴瘤分期和分型呈负相关，恶性度增殖越活跃，蛋白表达率越降低，说明P16蛋白表达对细胞增殖有负相关调控作用.国外文献报道STI571可上调U266细胞周期抑制蛋白P16、P16的表达水平，阻滞瘤细胞于G0/G1期，进而阻断细胞周期的进程[8]，但STI571对淋巴瘤P16蛋白表达的研究报道较少见，从而启示我们将此药物应用于淋巴瘤细胞中，观察P16蛋白的表达情况.本实验中，将不同浓度的STI571经不同时间作用于Raji细胞中，结果显示STI571对Raji细胞P16的表达并无显著影响.应用10.0μmol/L的STI571时，P16蛋白在用药后虽有增长趋势，但只在72 h时出现明显差异，25.0μmol/L时，P16蛋白在48 h及72 h时间点上与对照组相比出现显著差异，所以提示实验所取的STI571浓度及药物作用时间对P16蛋白的表达产生一定的影响，不同浓度的STI571经不同作用时间对Raji细胞产生不同的作用效果.

综上所述，一般浓度下STI571对Raji细胞的凋亡可能无影响，高浓度时可以上调P16蛋白的表达，因此，将STI571用于淋巴瘤的治疗还有一定的争议，需要进一步研究分析.

[1]Rassidakis G Z，Georgakis G V，Dyaizo M，et al.Lack of c-kit(CD117)expression in CD30+lymphomas and lymphomatoid papulosis[J].Mod Pathol，2004，17(8)：946-953.

[2]秦亚溱，陈珊珊，常艳.STI571诱导K562细胞凋亡机制研究[J].中华血液学杂，2002，23(6)：289-292.

[3]Atanasio P，Xonia C V，Soraya T，et al.Imatinib mesylate (STI571)inhibitsmultiplemyeloma cell proliferation and potentiatesthe effectof common antimyeloma agents[J].British Journal of Haematology，2003，123(5)：858-868.

[4]AldinucciD，Poletto D，NanniP，etal.Hodgkin and Reed-Sternberg cellsexpress functional c-kit receptorsand interactwith primary fibroblasts from Hodgkin's disease-involved lymph nodes through soluble and membrane-bound stem cell factor[J].Br JHaematol，2002，118(4)：1055-1064

[5]Brauns T，Schultewolter T，Dissmond J，etal.C-KIT expression in primary cutaneous T-cell lymphomas[J].JCutan Pathol，2004，31：577-582.

[6]Gibson SL，Dai CY，LeeHW，etal.Inhibitionofcolon tumorprogression and angiogenesisby the INK4a/Arf locus[J].CancerRes，2003，63(4)：742-746.

[7]杨年兰，陈燕，李崇渔.8种人恶性淋巴瘤细胞系P16基因突变的研究[J].同济医科大学学报，2001，30(3)：229-231.

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Experimental Study of G leevec in M alignant Lym phoma Raji Cell Apoptosis and Proliferation

MA Lin，MA Liang-ming
(School ofMedicine，Shanxi Datong University，Datong Shanxi，037009)

Objective To investigate the effect of gleevec with different concentration on Raji cells and the mechanisms Methods The inhibition of cell proliferation wasmeasured by MTT assay to assess the cells survival after STI571 treatment with different concentration at indicated time.Caspase-3 activeness changeswere determined by flow cytometry(FCM)after treatmentwith STI571 in different concentration at indicated time.The relative number of cells in different phases and the percentages of cells calculated in G1and S phase of the cell cycle were assessed by FCM after treatment with STI571 in different concentration at indicated time.The expression of p16protein was analysed by SABC immunohistochemical method after treatment with STI571 in different concentration at indicated time.Results The results of MTT assay showed that STI571 could inhibit Raji cells growth.There was clear statistical significance between the union groups and the single-drug group(P＜0.05).Raji cell lines were less sensitive to gleevec(P＞0.05).At higher concentration and longer time，STI571 could up-regulated the optical density of P16protein.And it was found that STI571 had no effecton Raji cell cycle.(P＞0.05).Conclusions The results showed that STI571 might affect the expression of P16protein athigher concentration.

acenious acid;gleevec；lymphoma；caspase-3；P16；cell cycle

R733

A

1674-0874(2010)02-0065-04上清液，清洗，各加入Caspase-3 10μL，静置，用流式细胞仪分析细胞凋亡，实验每组重复3次.

〔编辑 杨德兵〕

2010-01-05

马莉(1978-)，女，山西清徐人，硕士，助教，研究方向：淋巴瘤.