基于线粒体COI及Cytb基因的4种鱚科鱼类系统发育研究3

薛泰强,杜 宁,高天翔

(中国海洋大学水产学院,山东青岛266003)

研究简报

基于线粒体COI及Cytb基因的4种鱚科鱼类系统发育研究3

薛泰强,杜 宁,高天翔33

(中国海洋大学水产学院,山东青岛266003)

采集中国近海分布的多鳞鱚(Sillago sihamaForskǎl)、少鳞鱚(S.japonicaTemminck and Schlegel)、斑鱚(S. aeolusJordan and Evrmann)及澳大利亚南部海域的银鱚(S.bassensisCuvier)等4种鱚科(Sillaginidae)鱼类样品,对其线粒体COI及Cytb基因片段进行了扩增和序列测定,分析比较了不同鱚属鱼类种间的序列差异。研究结果表明,4种鱚属鱼类COI基因片段序列长度均为610 bp,A+T平均含量略大于G+C含量,分别为52.9%和47.1%;Cytb基因片段序列长度均为402 bp,A+T平均含量大于G+C含量,分别为53.7%和46.3%。4种鱚科鱼类种内没有序列差异或变异极小,而种间差异远远大于种内差异;Cytb基因系统树支持了形态学研究的结果;其种间遗传距离在0.225～0.286之间。根据Cytb基因每百万年2%的分歧速率计算,多鳞鱚与少鳞鱚的分歧时间约为1 140万年,少鳞鱚与斑鱚的分歧时间约在1 115万年,其分化事件均发生在中新世(Miocene)。根据遗传距离构建的系统树表明,多鳞鱚与少鳞鱚亲缘关系较近,而与银鱚较远。

鱚科;COI;Cytb;系统发育;分化年代

鱚科(Sillaginidae)鱼类属于硬骨鱼纲(Osteich2 thyes)、鲈形目(Perciformes),主要分布于太平洋西岸及印度洋,属近岸种。鱚科鱼类肉质十分细嫩,深受当地居民喜爱,许多种类在其分布区为经济鱼种[1]。中国近海分布的鱚科鱼类仅报道有鱚属(Sillago)1属、3种,包括斑鱚(Sillago aeolusJordan and Evrmann)、少鳞鱚(Sillago japonicaTemminck and Schlegel)和多鳞鱚(Sillago sihamaForsk…l)3个种[2]。到目前为止,国内学者对多鳞鱚的食性和营养级、室内养殖试验、早期发育形态观察和外周血细胞显微结构观察等进行了研究[326],国外学者主要开展了鱚科鱼类的形态学分类的研究,日本学者对于日本国内将少鳞鱚误认为多鳞鱚的错误进行了修正,此外还对馆山湾(Tateyama Bay)少鳞鱚的年龄和生长、纤鱚(S.ciliata)仔鱼鳔膨胀系数等进行了研究[729]。关于鱚科鱼类的遗传学研究报道极少,迄今GenBank中尚未见登录的Cytb基因序列。

动物线粒体DNA(mtDNA)具有分子量小、进化速度快、结构简单和母性遗传等特点,已被广泛应用于分子遗传学的研究,尤其是在近缘种间和种内群体间的遗传分化研究方面更具优势[10211]。本文以采自我国近海的斑鱚、少鳞鱚和多鳞鱚及澳大利亚南部海域的银鱚(Sillago bassensis)作为研究对象,对这4种鱚科鱼类线粒体DNA的COI及Cytb基因片段进行了PCR扩增和序列测定,分析比较了其种间变异程度及亲缘关系,以期为鱚科鱼类分类地位及物种多样性研究提供基础依据,其研究结果对鱚科鱼类准确鉴定及其渔业管理也具有重要意义。

1 材料与方法

1.1 实验材料

斑鱚样品于2009年4月采自广东大亚湾,少鳞鱚样品于2009年6月采自福建厦门近海,多鳞鱚样品于2009年4月采自广东大亚湾,银鱚样品于2008年7月采自澳大利亚南部海域。实验中每种各取4尾,取肌肉组织后-70℃以下保存,以备DNA提取。

1.2 实验方法

1.2.1 基因组DNA提取 取样品肌肉100 mg左右,用传统的酚2氯仿法提取基因组DNA,-20℃下保存备用。

1.2.2 COI及Cytb片段PCR扩增 用于扩增COI和Cytb基因片段的引物序列分别为:L59562COI(5’2 CACAAAGACATT GGCACCCT23’)和H65582COI (52CCTCCTGCA GGGTCAAAGAA-3’)、L14734 (5’2AACCAC CGTTGTTATTCAACT23’)和CYTB (5’2CTCAGAATGACATTTGTCCTCA23’)[12]。PCR扩增在Biometra扩增仪上进行,COI基因片段扩增反应条件为94℃预变性4 min;94℃45 s,52℃40 s,72℃45 s,30个循环;72℃延伸15 min;Cytb基因片段扩增反应条件为94℃预变性4 min;94℃40 s,52℃40 s,72℃50 s,30个循环;72℃延伸15 min。

反应总体积25μL,其中包含10×Buffer 5μL, dNTP 2μL,引物各1μL,Taq DNA聚合酶0.15μL,及DNA模板1μL,其余用去离子水补至25μL。取PCR产物2μL在1.5%的琼脂糖凝胶中进行电泳,紫外灯观察并拍照记录。

1.2.3 PCR产物回收测序 PCR产物使用胶回收试剂盒(Axgen公司)纯化,取适量纯化产物作为测序反应的模板,送上海桑尼生物科技有限公司进行双向测序,以确保序列的准确。

1.2.4 序列分析 使用Lasergene 7软件包比对序列,DNASP[13]软件检测多态位点(Polymorphic sites)、简约信息位点数(Parsimony informative sites)和序列的碱基组成。使用Modeltest 3.7[14]软件进行模型筛选,得到最佳替代模型并计算相关参数。应用MEGA 4.1[15]软件将Cytb蛋白质编码基因核苷酸序列的密码子转化为氨基酸序列,分析氨基酸组成并计算遗传距离。基于邻接法(NJ)、最大简约法(MP)[16]和贝叶斯法(Bayes)[17]重建COI及Cytb基因片段的系统树。

2 结果

2.1 替代模型选择和参数估计

Modeltest分析结果显示,NJ、Bayes法构建4种鱚科鱼类COI基因片段系统树的最适核苷酸替代模型均为HKY+G(hLRTs),并得到模型相关参数,包括模型的似然值自然对数的负数(-lnL=1847.4840)、K值(5)及Gamma分布的形状参数(G=0.2011)。

NJ法构建4种鱚科鱼类Cytb基因片段系统树,最适核苷酸替代模型为HKY+I+G(hLRTs),并得到模型相关参数,包括模型的似然值自然对数的负数(-lnL=1 276.450 0)、K值(6)、不变位点比率(I= 0.432 0)和Gamma分布的形状参数(G=0.158 2)。

Bayes法构建4种鱚科鱼类Cytb基因片段系统树,最适核苷酸替代模型为GTR+G(hLRTs),得到的模型相关参数为,似然值自然对数的负数(-lnL= 1 273.326 3)、K值(9)、Gamma分布的形态参数(G= 0.148 9)。

2.2 基因序列分析

2.2.1 COI基因序列分析 扩增得到4种鱚科鱼类的mtDNA COI基因片段长度为610 bp,经比对、校正后的序列提交GenBank,登录号为HM1314712 HM131486。

4种鱚科鱼类COI基因片段序列中,银鱚存在3个单倍型,少鳞鱚存在4个单倍型,斑鱚和多鳞鱚种内个体间均无碱基差异。共发现178个多态位点,约占35.6%;217个核苷酸替代(Nucleotide substitution),其中158个为转换(Transition),59个为颠换(Trans2 version),转换颠换比(Ts/Tv)约为2.68;无插入缺失。平均碱基含量分别为A 30.0%,T 22.9%,C 19.3%, G 27.8%;4种鱚科鱼类COI基因片段的A、T、C和G的平均含量分别为银鱚32.0%,23.6%,18.5%, 25.9%,斑鱚28.4%,22.8%,20.3%,28.5%,少鳞鱚30.5%,23.0%,19.1%,27.5%,多鳞鱚29.0%, 22.5%,19.0%,29.5%。A+T略有差异,但高于G+ C(见图2)。

利用软件重建COI基因片段NJ、MP及Bayes系统树,3种系统树拓扑结构一致,多鳞鱚先与斑鱚聚为一支,再与少鳞鱚聚为一支,最后与银鱚聚类(见图1)。

图1 基于COI基因片段序列的4种鱚科鱼类系统树(Bootstrap检验值依次为NJ/MP/Bayes)Fig.1 Phylogenetic tree of Sillaginidae species based on COI gene sequence(The bootstrap value showed in order of NJ/MP/Bayes)

由Kimura双参数法计算种间遗传距离,得到斑鱚与银鱚之间的遗传距离最大,多鳞鱚与银鱚之间的遗传距离最小。

表1 基于Cytb基因序列的4种鱚科鱼类种间净遗传距离Table 1 Interspecific genetic distances in 4 Sillaginidae species based on COI gene sequences

2.2.2 Cytb基因序列分析 扩增得到4种鱚科鱼类的线粒体基因片段长度为416 bp,通过同源序列比对,选取长度为402 bp的Cytb基因片段序列进行分析。所测序列均已提交GenBank,登录号为HM1314552 HM131470。

图3 4种鱚科鱼类Cytb基因片段核苷酸序列比较Fig.3 Nudeotide alignment of partial Cytbgene of 4 Sillaginidae species

4种鱚科鱼类Cytb基因片段序列中,银鱚存在2个单倍型,少鳞鱚存在3种单倍型,斑鱚和多鳞鱚种内个体间均无碱基差异。共发现131个多态位点,约占32.3%,全部为多变异位点;163个核苷酸替代(Nucle2otide substitution),其中112个为转换(Transition), 51个为颠换(Transversion),转换颠换比(Ts/Tv)约为2.20;无插入缺失。平均碱基含量分别为A 23.3%,T 30.4%,C 28.7%,G 17.6%;4个种类Cytb片段的A、T、C和G的平均含量分别为银鱚24.5%,31.8%, 26.7%,17.0%,斑鱚22.1%,28.4%,31.3%,18.2%,少鳞鱚24.1%,31.5%,27.5%,17.4%,多鳞鱚22.4%,30.1%,29.9%,17.7%。A+T含量趋势与COI基因片段结果相似,与其他鱼种Cytb基因研究结果一致[18219](见图3)。

编码基因部分片段中,大部分突变为同义突变(Synonymous substitution),最普遍的核苷酸替换是发生在密码子第三位上的转换,131处突变中有117发生于密码子第三位点,11处位于密码子第一位点,3处位于密码子第二位点。在Cytb基因134个氨基酸的序列上,4种间检测到7处氨基酸替代(amino acid substitution),其中4处由密码子第一位点上的核苷酸替代引起,3处由密码子第二位点上的核苷酸替代引起,不存在由密码子第三位点上的核苷酸替代引起的氨基酸替代(见图4)。

图4 4种鱚科鱼类Cytb氨基酸序列比较Fig.4 The amino acid sequences alignment of portial cytbgene of 4 Sillaginidae species

利用软件重建Cytb基因片段NJ、MP及Bayes系统树,其拓扑结构一致,多鳞鱚先与少鳞鱚聚类,再与斑鱚聚类,最后与银鱚聚类,与COI基因片段的系统树结构不一致(见图5)。2.3几种鱚属鱼类种间的分化年代

图5 基于Cytb基因片段序列(左:Bootstrap检验值依次为NJ/MP/Bayes)和形态特征构建(右:仿中坊徹次、Mckay等)的鱚科鱼类系统发育树Fig.5 Phylogenetic trees of Sillaginidae species based on Cytbgene sequence (left,The bootstrap value showed in order of NJ/MP/Bayes)and morphology data(right,from Nakabo,McKay,et al.)

表2 基于Cytb基因序列的4种鱚科鱼类种间遗传距离Table 2 Interspecific genetic distances in 4 Sillaginidae species based on Cytbgene sequences

由Kimura双参数法计算得到种间净遗传距离(见表2),结果显示银鱚与我国的3种鱚鱼间的差异较大,最大净遗传距离为0.285;多鳞鱚与少鳞鱚的净遗传距离为0.228,少鳞鱚与斑鱚间的净遗传距离为0.223,多鳞鱚与斑鱚间净遗传距离为0.247。将每百万年2%的核苷酸分歧速率[11]应用于4种鱚科鱼类的Cytb基因片段上,得到多鳞鱚与少鳞鱚的分歧时间约为1 140万年,少鳞鱚与斑鱚的分歧时间约在1 115万年,而多鳞鱚与斑鱚的分歧时间约在1 235万年。鱚科鱼类种间分化事件均发生在中新世(Micene)。姐妹群的种类作为外群对照研究,但是鱚科鱼类在鲈形目中处于非常特殊的地位,至今无法确认其姐妹群[1],因此,仅对4个种进行了研究。

4种鱚科鱼类不同种间的Cytb净遗传距离在0.223～0.285之间,银鱚与多鳞鱚的遗传距离最大,斑鱚与少鳞鱚之间的遗传距离最小,种内的遗传距离为0或极小。分子钟假说认为,某一特定大分子(蛋白质或DNA分子)在所有的世系(Lineage)中,核苷酸替代速率在时间上是稳定的。基于哺乳动物的研究数据,目前许多研究者将每百万年2%的核苷酸分歧速率应用于Cytb基因片段序列来研究硬骨鱼类的分化年代[21223]。推算4种鱚科鱼类间的分化事件在1 115～1 425万年前,成种事件发生于中新世(Miocene)。Schwarzhans研究指出鱚科鱼类很可能于始新世晚期(Lower Eocene)起源于特提斯海(Tethys Sea,古地中海),在中新世,许多印度洋-太平洋的鱚科鱼类发展成为了当地种。德国及法国发现的耳石化石可以从中新世晚期(Lower Miocene)追溯到渐新世早期(Upper Oligocene)[1]。本文基于线粒体Cytb基因片段得到的结果支持了上述结论。

4种核苷酸在线粒体基因组中分布不均一是动物线粒体基因组的共性[24]。本研究得到的Cytb基因片段核苷酸组成中的鸟嘌呤(G)含量普遍较低,4种鱚科鱼类的的Cytb蛋白质编码基因第三密码子位点的核苷酸组成存在较大偏倚(Bias),C的平均含量为41.0%;而G的平均含量只有9.1%。在其他鱼类中, Cytb基因片段核苷酸组成分析的结果也显示G含量普遍较低,这一点在密码子第三位点上尤为明显[25227]。对于编码重要功能蛋白质的Cytb基因来说,由于在DNA水平上受自然选择压力的影响,密码子第三位点的突变率高于第一和第二位点,而且密码子第三位点的突变绝大多数是同义突变,受自然选择压力较小,突变后易固定,所以密码子第三位点能够更清晰地表明线粒体基因组核苷酸组成的不均一性[21],而第一、第二位点则相反。

密码子第三位点上的突变很少导致氨基酸替代(同义替代),所以比导致氨基酸替代的突变(非同义替代)积累得快得多,最常见的突变是密码子第三位点上的转换,其次是第一密码子位点上的无义转换和密码子第三位点上的颠换[21]。本研究中Cytb作为编码重要蛋白质的基因片段,在编码的134个氨基酸序列上,由于密码子第一位点的非同义替代造成4处氨基酸替代,3处由密码子第二位点上的核苷酸替代引起,不存在由密码子第三位点上的核苷酸替代导致的氨基酸替代,与其他学者的研究结果基本一致[21]。

目前,不同鱚科鱼类的种类鉴定主要依靠形态学

3 讨论

鱚科鱼类仅分布于太平洋西岸及印度洋,共3属31种,其中最大的为鱚属,共有29种。本文研究的4种鱼类均属于鱚科、鱚属[122]。关于鱚科鱼类的分类和系统发育的研究,目前国内及国外的研究都局限于形态学基础上的分类,如中坊徹次和林公義等对日本分布的鱚科鱼类进行了形态学研究[20],Mckay等对全世界鱚科鱼类的形态学分类进行了描述[1],迄今尚未见相关遗传学报道。本文测定多鳞鱚、少鳞鱚、斑鱚和银鱚线粒体DNA的COI及Cytb基因片段序列,分析结果显示2个基因片段在4种鱚科鱼类种间的差异均十分明显,适用于鱚科鱼类种类鉴定。

本文使用NJ、MP和Bayes 3种方法构建的系统树拓扑结构一致,但2个基因片段系统树的拓扑结构不完全一致。COI基因片段系统树显示,多鳞鱚先与斑鱚聚为一支,再与少鳞鱚聚为一支,最后为银鱚。而Cytb系统树则显示多鳞鱚先与少鳞鱚聚为一支,再与斑鱚聚为一支,然后与银鱚聚类。基于Cytb基因片段构建的系统树与Mckay和中坊徹次等基于形态特征建立的系统树完全吻合,支持了形态学分类的结果[1,20],可能其结果更加贴近真实情况,Cytb片段应更适合于鱚科鱼类的系统发育研究。实验中本应使用特征,但由于鱚科鱼类的外形、体色十分相似,形态特征差异很小,且生活习性也基本类似,均为近岸底栖的小型鱼类,所以在分类上存在一定的混乱,很多真正存在的种类,极有可能被一些广布种所掩盖,成为隐藏种而未被发现[1]。本文的研究结果显示,各种鱚科鱼类线粒体COI及Cytb基因均十分保守,能够很好的区分这些种类。今后可以作为DNA条形码应用于鱚科鱼类的分子分类研究,其准确度将会大大提高。

鱚科下属的种类繁多,目前仅对这4种鱚鱼的两个线粒体DNA基因片段进行了序列测定分析。尽可能收集鱚科鱼类样品,从形态特征和分子生物学2个方面进行深入研究,结合鱚科鱼类的地理分布,才能更系统、更准确地探讨它们的起源、分化及地理分布格局的成因。

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责任编辑 于 卫

Phylogenetic Relationships of 4 Sillaginidae Species Based on Partial Sequences of COI and Cytochrome b Gene

XUE Tai2Qiang,DU Ning,GAO Tian2Xiang
(College of Fishery,Ocean University of China,Qingdao 266003,China)

In order to identify the differentiation of species of Sillaginidae fishes,sequence comparison of mtDNA COI and cytochromeb(Cytb)gene fragments were employed forSillago sihama,S.jamonica, S.aeolus(from China),S.bassensis(from Australia).Nucleotide sequences of 610 bp were obtained in COI gene;the percentage of A+T content was little higher than C+G,it’s 52.9%and 47.1%respective2 ly.The nucleotide sequences of Cytbgene were 402bp;the percentage of A+T content was higher than C+G,it’s 53.7%and 46.3%respectively.Sequence analysis indicated that the variation level of inter2 species was high.The phylogenetic tree based on Cytbgene supports morphology results;the estimated time of divergence betweenS.sihama and S.japonicawas 11.40 million years ago,betweenS.japonica andS.aeolus was11.15 million years ago.The result indicated a Miocene divergence of the four species. Based on the genetic distances,phylogenetic tree was made and indicated that the genetic distance between S.aeolusandS.japonicawas minimum among 4 species,and the genetic distance betweenS.bassensis andS.sihamawas maximum.

Sillaginidae;COI;Cytb;phylogeny;divergence time

book=40,ebook=13

Q959.483

A

167225174(2010)09Ⅱ2091208

海洋公益性行业科研专项经费项目(20090501922)资助

2009201214;

2010204215

薛泰强(19842),男,硕士生。E2mail:jerry_xue@yahoo.cn

33通讯作者:E2mail:gaozhang@ouc.edu.cn