土壤硝酸盐污染的生物修复试验研究

刘 咏, 严小三, 张 婷

(1.合肥工业大学 生物与食品工程学院,安徽 合肥 230009;2.合肥工业大学 资源与环境工程学院,安徽 合肥 230009)

近几十年来,随着工农业生产的发展,农村、城市的地下水都存在着不同程度的氮污染问题,农业化肥的过量使用,尤其是氮肥的过量使用和动物排泄物的处置不当,使世界许多地方地表水和地下水中硝酸盐氮的含量在不断升高,已经危及包气带土壤和地下水的质量安全,硝酸盐污染日趋严重[1]。

土壤中的硝酸盐主要被农作物吸收,浇水灌溉也使硝酸盐渗入、污染地下水体。蔬菜极易吸收和富集硝酸盐,从调查结果[2]来看,过量施用氮肥使土壤中的硝酸盐含量明显升高,直接导致蔬菜硝酸盐过多积累,尤其是叶菜类[3]。硝酸盐摄入人体后可转化为亚硝酸盐、亚硝酸胺,甚至致癌[4]。因此,开展土壤硝酸盐控制途径的研究,对降低农作物及蔬菜中硝酸盐含量,生产绿色食品有着极其重要的意义。

降低土壤中过量硝酸盐是降低农作物与蔬菜硝酸盐含量的根本途径。利用微生物进行生物反硝化作用去除地下水中过量的硝酸盐已经被广泛研究[5-9]。文献[10]对芦苇湿地去除硝酸盐污染进行研究,分析了芦苇在生物反硝化作用中的重要作用以及与反硝化细菌之间的关系。但生物反硝化用于去除土壤中过量硝酸盐鲜见报道。为了寻求廉价而有效的土壤硝酸盐修复途径,本文采用从巢湖湿地土壤中分离筛选出的高效兼性厌氧的异养反硝化细菌Klebsiella sp.DB-1,利用废弃的农作物秸秆作为微生物碳源,进行土壤硝酸盐修复。

1 材料与方法

1.1 材 料

菌株：本实验室从巢湖湿地分离筛选,经过16SDNA鉴定并保存的高效反硝化菌株 Klebsiella sp.DB-1。

土样：从合肥工业大学校园花坛处采集地表下0.5 m深的包气带土壤,土壤中 w硝酸盐氮为12 mg/kg,风干用2 mm筛过筛备用。

富集培养基[11]：蛋白胨 10 g/L,硝酸钾1 g/L,1000 mL水,pH 值为7.3～7.6。

固体碳源：玉米秸秆、稻草秸秆、芦苇秸秆、蒲苇秸秆。

1.2 实验方法

1.2.1 菌株利用农作物秸秆去除土壤硝酸盐氮

包气带土壤的生物反硝化作用是在反硝化细菌的作用下,将硝酸盐还原为N2的整个过程,是包气带土壤对硝酸盐污染的自净功能,本文采用异养反硝化菌株K lebsiella sp.DB-1,对促进地下水环境保护具有一定的实际意义。

取风干筛分过的土样各100 g,将4种秸秆(玉米、稻草、芦苇、蒲苇)切碎(粒度为 5～10 mm),分别与土样混匀,秸秆用量为每100 g土壤5 g,分装于250 mL烧杯中,然后分别添加适量的硝酸钾溶液,使土壤中 w硝酸盐氮达到200 mg/kg左右,并分别添加适量的蒸馏水使土壤含水达过饱和状态,用塑料膜密封烧杯口,保持厌氧环境。灭菌后,按照土壤的用量添加菌株Klebsiella sp.DB-1的种子液,接种量为每100 g土壤10 mL,种子液每次使用前以无菌水调整其OD值(660 nm)为0.5,接种后放在28℃下恒温培养,每隔一定的时间取样测定土壤硝酸盐氮含量,根据土壤硝酸盐氮的去除率确定最佳固体碳源。

从烧杯中随机取土样0.2 g,加30 mL水溶解,过滤后,加入1 mL氢氧化铝悬浮液[12],再过滤得澄清水样,取水样1 mL,用酚二磺酸分光光度法[11]测量硝酸盐氮的含量。

1.2.2 秸秆用量对硝酸盐氮去除率的影响

各称取100 g风干筛分的土样分装于250 mL烧杯中,将优选出的最佳秸秆切碎,每100 g土壤中添加秸秆的量分别为 3、5、7、10、12 g,与土样混匀,以不添加秸秆的土壤作为对照。然后分别添加硝酸钾,使土壤中w硝酸盐氮达到200 mg/kg左右,其余步骤同1.2.1,由所测结果确定出最佳碳源用量。

1.2.3 菌株对初始硝酸盐氮的耐受性

采用最佳碳源及其最佳用量,使土壤中w硝酸盐氮分别约为50、100、150、200、250 mg/kg。其余操作同1.2.1,考查菌株对初始硝酸盐氮的耐受性。

1.2.4 土壤酸碱度对菌株反硝化活性的影响

各称取100 g风干筛分的土壤分装于烧杯中,添加适量的硝酸钾和固体碳源混匀,测定土壤初始pH值,用0.1 mol/L的氢氧化钠调节pH值,使各烧杯土样的 pH 值分别为 5、6、7、8、9。其余步骤同1.2.1,由所测结果确定菌株对土壤最适pH值的要求。

2 结果与分析

2.1 不同农作物秸秆去除硝酸盐的效果

反硝化菌株Klebsiella sp.DB-1利用农作物秸秆作为碳源,对土壤中硝酸盐进行原位生物修复,土壤硝酸盐氮的去除率随时间变化,结果如图1a所示。

由图1a可以看出,在整个生物反硝化过程中,土壤硝酸盐氮的去除率均随时间的延长而处于上升趋势,但上升幅度因农作物秸秆碳源的种类而异。在0～24 h内,反硝化菌株Klebsiella sp.DB-1利用蒲苇秸秆去除硝酸盐氮的速度最快,菌株利用其它几种秸秆均存在24 h的延迟期,起始反硝化作用较弱。24～60 h,这个阶段是菌株的指数生长期,菌株利用这4种秸秆去除土壤硝酸盐氮的速度都明显加快,硝酸盐氮的去除率迅速提高;60 h以后,硝酸盐氮的去除缓慢,基本达到稳定。在生物反硝化过程中土壤硝酸盐含量都处在一个下降的趋势,不同农作物秸秆被反硝化细菌利用的效果存在一定的差异,但总体较好,在96 h时,菌株利用蒲苇秸秆作碳源使土壤硝酸盐氮的去除率达到94.9%,芦苇秸秆使土壤硝酸盐氮的去除率为88.4%,玉米和稻草分别为87.5%和 85.9%。反硝化菌株 Klebsiella sp.DB-1利用蒲苇秸秆去除硝酸盐氮的效果最好,其次为芦苇秸秆,玉米和稻草的反硝化效果稍差。

2.2 最佳秸秆用量

将最佳碳源蒲苇秸秆按照不同的用量比例添加到土壤中,分别接种相同的反硝化菌液浓度,蒲苇秸秆用量对菌株去除土壤硝酸盐氮的影响,如图1b所示。从图1b可知,土壤中蒲苇秸秆的添加量不同,反硝化菌株Klebsiella sp.DB-1的反硝化活性差异较大。当土壤中不添加蒲苇时,由于土壤本身含有少量的碳源,也能够为菌株提供电子受体,土壤硝酸盐也略有下降,可以看到土壤中硝酸盐氮的去除率有一定的上升,在108 h硝酸盐氮的去除率达到30.9%;而添加蒲苇的量不同,菌株在反硝化过程中对硝酸盐氮的去除率总体呈上升趋势,但上升幅度不同;并不是秸秆的添加量越多越好,每100 g土中添加5 g蒲苇的比例在实验周期内硝酸盐氮去除率上升的幅度最大,在84 h基本趋于稳定,在108 h内土壤中w硝酸盐氮由394 mg/kg降低到74.5 mg/kg,硝酸盐氮的去除率达到81.1%。因此,可以确定最佳碳源用量为每100 g土壤中5 g蒲苇。

2.3 不同含量硝酸盐污染时的去除效果

在土壤中初始硝酸盐氮含量不同时,菌株Klebsiella sp.DB-1去除土壤硝酸盐氮的结果,如图1c所示。

图1 土壤中硝酸盐氮的变化情况

整个实验过程中土壤硝酸盐氮含量都处于下降趋势,在0～24 h内下降比较缓慢,不同初始硝酸盐氮含量的土壤中,硝酸盐氮含量的下降幅度略有不同,在土壤中 w初始硝酸盐氮为100 mg/kg下,硝酸盐氮的去除率升高较明显;24～48 h内,在菌株的反硝化作用下土壤硝酸盐氮含量都迅速下降,原因可能是菌株经过24 h的停滞期之后生长繁殖迅速;下降幅度较大的是200 mg/kg土壤和250 mg/kg土壤,土壤中 w硝酸盐氮分别降到了51.8 mg/kg和55 mg/kg;60 h以后土壤硝酸盐氮含量下降普遍缓慢,可能是由于菌株的生长周期进入衰亡期,菌株数量减少所致。从图3可见,土壤中初始硝酸盐氮含量越高,相同浓度菌液去除硝酸盐氮的效果越好,菌株能够耐受较高含量的硝酸盐氮,土壤中 w初始硝酸盐氮为 200 mg/kg和250 mg/kg的实验组,在108 h时硝酸盐氮的去除率分别达到91.7%和89.9%。

2.4 不同pH值对去除土壤硝酸盐的影响

土壤pH值对菌株去除硝酸盐氮的影响,如图2所示。整个过程中硝酸盐氮含量都呈下降的趋势,在12～48 h、pH 值为7～9的实验组土壤硝酸盐氮含量下降幅度较快,在48 h,pH=9的硝酸盐氮的去除率最大(63%),到108 h时达到67.7%;pH=7实验组中硝酸盐氮去除率变化趋势不稳定,但是整个过程中都处于增长的状态,到108 h时,硝酸盐氮去除率增加到67.3%。

图2 不同pH值下硝酸盐氮去除率变化

当土壤pH=5时,硝酸盐氮含量下降趋缓,最终硝酸盐氮去除率只有49.1%,这与文献[13]当pH＜6.5时反硝化速率很快下降的研究结论相同。因而,pH值在中性偏碱(7～9)时,菌株的反硝化速率比较快,效果较好。

3 讨 论

通过上述实验,可以确定反硝化菌株Klebsiella sp.DB-1利用固体秸秆修复包气带土壤硝酸盐污染具有一定的实效性。实验结果(图1)表明,反硝化细菌Klebsiella sp.DB-1能够直接利用农作物秸秆,在一定时间内修复土壤硝酸盐污染。图2所示为蒲苇秸秆作为碳源的最佳用量结果,该结果体现了反硝化菌株对固体碳源的需求量并非越高越好。由实验确定的秸秆最佳用量为每100 g土壤中5 g,即使对于大面积包气带土壤硝酸盐污染的生物修复,也不存在过量的问题,原因如下：①秸秆的添加可以采用土壤翻耕的方式加入土壤中,其深度不可能影响地下水质;②由于土壤微生物的协同分解作用,秸秆被微生物分解吸收,不会直接进入地下水而造成地下水体的二次污染;③如果菌株利用固体碳源直接修复水体硝酸盐污染,可能会产生色度、COD、有机碳残留等一系列问题。本研究目的是降低土壤中积累的硝酸盐,包气带土壤中所含的水分较少,农作物生长需要吸收水分,土壤本身具有过滤作用,因此,能够阻控地下水体的污染。

根据本研究的结果,如果在硝酸盐污染严重地区,选择农田某一层位的土壤,利用微生物与秸秆进行原位修复是可行的,既可在原位有效地修复土壤硝酸盐污染,又能够增加土壤的肥力,对修复污染和农作物增产将会有益。

4 结 论

本研究利用反硝化菌株Klebsiella sp.DB-1修复包气带土壤硝酸盐污染,采用农作物秸秆作为固体碳源为菌株提供能源与电子受体,取得了较好的试验效果,为农作物秸秆的综合利用提供了实验依据。

(1)来源于巢湖湿地的反硝化菌株Klebsiella sp.DB-1能够利用玉米、稻草、芦苇和蒲苇秸秆作碳源,进行生物反硝化去除土壤硝酸盐,效果都较好,其中蒲苇为最佳,108 h时土壤中硝酸盐氮的去除率达到94.4%。

(2)以蒲苇为碳源研究其用量对菌株反硝化结果的影响,结果表明每100 g土壤中5 g的蒲苇秸秆用量最佳,108 h时土壤硝酸盐氮的去除率最大。

(3)针对土壤中硝酸盐含量不同,菌株Klebsiella sp.DB-1的适应性很强,对土壤中较高含量初始硝酸盐氮(如w初始硝酸盐氮为200 mg/kg),具有较高的生物修复效率。

(4)土壤酸碱度(pH值)对反硝化作用的影响较大,土壤呈酸性会抑制菌株的反硝化活性,而土壤呈中性偏碱(pH值为7～9)时,菌株的反硝化速率比较快,效果较好。

因此,利用反硝化细菌与农作物秸秆进行土壤硝酸盐的原位生物修复,不仅能够迅速降低土壤硝酸盐含量,还能够有效阻止土壤过量的硝酸盐对农作物、蔬菜及地下水的污染,同时,不会造成农田的二次污染。

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