胰腺癌肝转移相关分泌蛋白质的筛选

胡方方，周家华

(东南大学附属中大医院肝胆外科，江苏南京 210009)

胰腺癌是常见的消化道恶性肿瘤，而胰腺癌肝脏转移是导致胰腺癌治疗失败的主要原因之一［1］，肿瘤的转移是一个高度有序的、非随机的、器官特异性的过程。近来研究显示，肿瘤细胞可分泌一些可溶性蛋白诱导一群非肿瘤性的骨髓前体细胞，动员并植入远处特定的器官组织形成“预转移的小生境(the pre－metastatic niche)”，从而招募循环肿瘤细胞至特定的位点形成转移结节，而肿瘤细胞分泌的特定蛋白质在此过程中起关键作用，它们决定着肿瘤转移器官分布的特异性［2－3］。因此，筛选及鉴定与胰腺癌肝转移相关的分泌蛋白质对于阐明胰腺癌定向肝转移机制，寻找胰腺癌肝转移早期诊断、预后判断及药物治疗新靶点均具有重要意义。

本研究采用蛋白组学技术，分析比较一对来自同一亲本、具有不同肝转移潜能的胰腺癌细胞株分泌蛋白质的差异表达，以期筛选出与胰腺癌肝转移相关的分泌蛋白质，为寻找早期诊断胰腺癌肝转移的蛋白质标志物提供实验依据，亦为阐明胰腺癌定向肝转移的细胞及分子机制提供初步理论基础。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 细胞 人高肝转移潜能胰腺癌细胞株L3.6 pl由美国德州大学安德森肿瘤中心提供，人低肝转移潜能胰腺癌细胞株Colo－357由本实验室保存，前者为后者经裸鼠活体内连续筛选六轮获得［4］，二者具有完全相同的遗传背景。

1.1.2 试剂 RPMI 1640培养基、胰蛋白酶系Gibco公司产品;胎牛血清系杭州四季青公司产品;BCA蛋白定量试剂盒系碧云天公司产品;固相化pH梯度干胶条(IPG strip，24 cm，pH 3 ～10)、IPG 缓冲液(pH 3 ～10)、丙烯酰胺、甲叉双丙烯酰胺、三羟甲基氨基甲烷(Tris)、甘氨酸、十二烷基磺酸钠(SDS)、尿素(Urea)、CHAPS、过硫酸铵、碘乙酰氨(IAA)、二硫苏糖醇(DTT)均系通用公司产品;硝酸银、溴酚蓝、低熔点琼脂糖、硫代硫酸钠、甘油、EDTA、无水碳酸钠、冰醋酸均为国产分析纯试剂;质谱级胰蛋白酶、铁氰化钾、三氟乙酸(TFA)、碳酸氢铵、乙腈(CAN)和基质α－氰基－4－羟基肉桂酸(CCA)为Sigma公司产品。

1.1.3 仪器及生物信息学软件 恒温细胞培养箱系Espec公司产品;倒置相差显微镜系日本Olympus公司产品;IPGphor等电聚焦仪、Ettan DALTⅢ垂直电泳槽、Image scanner扫描仪、Image master凝胶图像分析软件系 Amersham Pharmacia公司产品;超滤离心管(截留相对分子质量10 000)系德国赛多利斯公司产品;MALDI－TOF－MS 质谱仪、Data Explorer质谱分析软件系Applied Biosystem公司产品;Mascot肽质量指纹图数据库查询软件系Matrixscience公司产品。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 用含10%胎牛血清的RPMI 1640培养基培养L3.6 pl和 Colo－357细胞至80%左右融合，弃去培养基，PBS缓冲液轻柔洗涤5遍后加入无血清、无酚红的RPMI 1640培养基，置于37℃，5%CO2条件下培养24 h。

1.2.2 细胞分泌蛋白质的提取 收集两种细胞的培养上清，于4℃下分别以1 000×g、3 000×g离心以去除残留细胞，吸取上清，利用直径0.45 μm的无菌滤器过滤以进一步去除细胞碎片，再使用分子截留量为10 000的超滤离心管对培养上清于4℃、5 000×g离心6 h行超滤处理，反复重复3次，以浓缩蛋白样品并除盐。采用BCA蛋白定量试剂盒测定样品蛋白浓度，蛋白样品分装后于－80℃冻存。

1.2.3 分泌蛋白质的双向电泳 将24 cm固相化pH梯度干胶条置于溶胀盘内水化过夜，将水化充分的IPG胶条转移至通用型杯上样胶条槽，将浓缩除盐后的蛋白样品(200 μg)经上样杯方式加至IPG胶条内，使用IPGphor等电聚焦仪进行第一向等电聚焦，参数设置为:(1)低电压水化，30 V 6 h，60 V 6 h;(2)升压，500 V 1 h step，1 000 V 1 h step;(3)梯度除盐，3 000 V 3 h gradient，8 000 V 3 h gradient;(4)等电聚焦，8 000 V step 8～10 h。待24 cm胶条等电聚焦达到80 000 Vh时，结束第一向等电聚焦。等电聚焦结束后将IPG胶条依次于10 ml平衡液Ⅰ(50 mmol·L－1pH 8.8 的Tris－HCl，6 mmol·L－1尿素，30% 甘油，2%SDS，痕量溴酚蓝，1%DTT)和 10 ml平衡液Ⅱ(50 mmol·L－1tris－HCl，pH 8.8，6 mmol·L－1尿素，30%甘油，2%SDS，痕量溴酚蓝，3%碘乙酰氨)中平衡15 min。平衡后的IPG胶条转移至12.5%SDS－PAGE胶上端，在Ettan DALTⅢ垂直电泳槽上进行第二向垂直电泳。参数设置为 P1 2 W·胶－1，30 min;P2 5 W·胶－130 min;P3 15 W·胶－16 h。在溴酚兰前缘运行到凝胶底部边缘时，终止电泳。剥离取下凝胶，将凝胶在固定液(无水乙醇100 ml、无水冰醋酸25 ml)中固定30 min，然后在敏化液作用30 min，蒸馏水漂洗后加入银染液［硝酸银1.25 g·(500 ml)－1，37%甲醛100 μl］中染色20 min，漂洗，显色3～5 min，终止显影10 min。

1.2.4 凝胶图像扫描及分析 银染显色后的凝胶用Image scanner TM扫描仪进行透射扫描，获得的数字化图像运用ImageMasterR 2D Elite(Version 2.00)软件进行蛋白质点的检测、量化、背景扣除、点的匹配(Match)。在两组图谱中蛋白质的表达量相差两倍的点被视为有差异的点，随机选取重复性和分辨率较高的10个差异蛋白质点进行后续质谱分析鉴定。

1.2.5 差异蛋白点的质谱分析 从凝胶中挖取差异蛋白点，50%乙腈和50 mmol·L－1碳酸氢氨脱色30 min，脱水冷冻抽干，再加入5 ng·μl－1序列修饰后胰酶，4℃放置30 min，加入25 mmol·L－1碳酸氢氨7.5 μl，37 ℃放置12 h，加入0.35 μl 2%TFA终止酶解反应。将样品和基质按1∶1等体积混合后吸取1 μl点样于点样靶上，干燥晾干后行MALDI－TOF－MS鉴定分析，在延迟解吸和反射模式下进行谱图采集，激光波长337 nm，加速电压设置19 kV。每一个肽谱图大约是由200次轰击垒加而成，外标采用布鲁克公司肽混合物标准品，内标采用胰蛋白酶的自切峰，分别为 m/z 842.50和 m/z 2211.10，最终获得肽质量指纹图谱(PMF)。

1.2.6 蛋白质数据库查询 将PMF结果利用Mascot搜索引擎检索蛋白质数据库，将实验得到的PMF和蛋白数据库中理论的PMF加以比较即可鉴定蛋白质。检索条件:蛋白质数据库选择SwissProt库，物种来源选择人类，酶选择Trypsin，允许不完全的酶解片段选择为1个，肽片段分子量最大允许误差为50 ppm，离子选择为MH+。

2 结 果

2.1 双向凝胶电泳结果

在相同条件下对L3.6 pl细胞和Colo－357细胞的分泌蛋白质分别进行了3次双向凝胶电泳分离，硝酸银染色显色后得到2－DE图谱各3张，两株细胞分泌蛋白质的图谱分布模式非常相似。经Image masterR 2D Elite(Version 2.00)软件分析，L3.6 pl细胞分泌蛋白质的3张凝胶平均检测到(840±20)个蛋白质点，Colo－357细胞分泌蛋白质的3张凝胶平均检测到(860±25)个蛋白质点，两组凝胶的匹配率为92%，将其中一块凝胶设定为参考胶，进行3块胶间的匹配分析得到平均匹配率分别为85.5%和88.6%。L3.6 pl和Colo－357细胞分泌蛋白质表达变化差异大于2倍的蛋白质点共20个，其中在L3.6 pl中上调表达蛋白11个，下调表达蛋白9个。由此，本实验获得了重复性、对比性均较好的L3.6 pl细胞和Colo－357细胞的分泌蛋白质的2－DE图谱。见图1、2。

图1 人胰腺癌细胞L3.6 pl和Colo-357分泌蛋白质双向凝胶电泳图谱(图中数字标识的是两株细胞间差异表达的蛋白质点)Fig 1 Representative 2-DE map of secretome of pancreatic cell lines L3.6 pl and Colo-357(the differentially expressed protein spots between L3.6 pl and Colo-357 were labelled with figures)

图2 部分差异表达蛋白质点的局部放大图Fig 2 Close-up image of partial differential expression protein spots between L3.6 pl and Colo-357 spot1 and spot2 were significantly higher in L3.6 pl than those in Colo－357，and spot4 was significantly lower in L3.6 pl than that in Colo－357

2.2 差异表达蛋白质点的质谱鉴定

从2－DE胶中挑选背景清晰、分辨率和重复性较好的10 个差异蛋白点(1、2、3、4、5、6、7、8、9、13、20 号点)，行MALDI－TOF－MS鉴定分析，本研究共成功鉴定出其中5个蛋白质点，分别为:1号点，组织蛋白酶D前体(Cathepsin D precursor);2号点，表皮型脂肪酸结合蛋白(epidermal－Fatty acid－binding protein，E－FABP);4 号点，视黄醛脱氢酶1(retinal dehydrogenase 1);5号点，二磷酸核苷激酶B(nucleoside diphosphate kinase B);6号点，膜连蛋白A1(annexin A1)。其中，组织蛋白酶D前体、表皮型脂肪酸结合蛋白在高肝转移潜能细胞株L3.6 pl中的表达水平高于低肝转移潜能细胞株Colo－357，而视黄醛脱氢酶1、二磷酸核苷激酶B、膜连蛋白A1在L3.6 pl细胞株中的表达水平低于Colo－357细胞株。1号蛋白点质谱鉴定结果见图3，得到鉴定的5个蛋白质点在双向凝胶上的位置和具体信息分别见图1和表1。

图3 1号蛋白质点的MALDI-TOF-MS质谱鉴定结果Fig 3 MALDI-TOF-MS analysis of protein spot 1 A.Peptide mass fingerprinting of protein spot 1;B.Database query results of spot 1，which was identified as Cathepsin D precursor with a Mascot score of 136

表1 质谱鉴定的L3.6 pl和Colo-357细胞的差异分泌蛋白质Tab 1 List of differentially expressed secretory protein spots of pancreatic cell lines L3.6 pl and Colo-357 identified by MALDI-TOF-MS

3 讨 论

分泌蛋白质可通过参与调控肿瘤细胞增殖、能量代谢、细胞运动、黏附及迁移、基质降解、血管生成等环节来影响肿瘤细胞的侵袭和转移能力。本研究采用比较蛋白组学的研究方法，对一对来自同一亲本、具有不同肝转移潜能的人胰腺癌细胞株L3.6 pl和Colo－357的分泌蛋白质进行分离、比较、筛选和鉴定，发现两者之间有20种分泌蛋白质的表达水平发生了明显改变，提示这些差异表达的分泌蛋白质可能与胰腺癌肝转移密切相关，胰腺癌肝侵袭转移的特性可能是众多蛋白共同作用的结果。本研究最终鉴定出其中5种与胰腺癌肝转移相关的分泌蛋白质，分别为组织蛋白酶D前体、表皮型脂肪酸结合蛋白、视黄醛脱氢酶1、二磷酸核苷激酶B、膜连蛋白A1。通过参考蛋白质数据库信息及检索相关文献发现，此5种候选差异蛋白质可能通过调控胰腺癌细胞的生长、增殖、黏附、运动、凋亡等功能来影响胰腺癌肝转移的病理进程。

组织蛋白酶D是一种天门冬氨酸肽链内切酶，其可以多种形式存在，分泌时为52 kU酶原，可自身降解为两条肽链组成的48 kU活性分子中间体，中间体进一步加工修饰为34 kU及14 kU的肽链片段为其成熟形式。组织蛋白酶D在恶性肿瘤中的侵袭转移过程中发挥重要作用，其通过降解细胞外基质和基底膜，并激活其他组织蛋白酶B(CB)及胶原酶，继而触发链式反应并最终促进肿瘤的浸润和转移［5］。组织蛋白酶D在某些肿瘤细胞中以无活性的前体形式存在。研究结果表明，这些无活性的前体在包括乳腺癌在内的许多肿瘤的增殖和转移过程中发挥重要作用［5－8］，在本研究中组织蛋白酶D前体在高肝转移潜能胰腺癌细胞株L3.6 pl中上调表达，提示组织蛋白酶D前体可能与胰腺癌肝转移密切相关。

E－FABP属于脂质结合蛋白超家族成员，是一种对脂肪酸有高亲和力的小分子量的可溶性蛋白质，广泛存在于哺乳动物组织和细胞中，主要在脂肪酸的摄取、转运及代谢调节中发挥作用。近来研究发现EFABP在胰腺癌［9］和结肠癌［10］的耐药细胞株中均呈过度表达，提示其可能与肿瘤的生长密切相关。进一步研究证实，E－FABP是癌基因c－myc的靶基因，并可被肿瘤相关抗原EpCAM诱导后快速上调表达［11］，c－myc和EpCAM可能作为E－FABP的上游因子，在特定阶段开启和关闭E－FABP的表达，调节肿瘤细胞的增殖和侵袭转移。然而，目前对E－FABP在肿瘤侵袭转移中的作用尚未明确。本研究发现，E－FABP在高肝转移潜能胰腺癌细胞株L3.6 pl分泌蛋白质中呈显著上调表达，提示其可能促进胰腺癌肝转移，而Uma等［12］研究表明舌鳞状细胞癌细胞的颈部淋巴结转移潜能与其E－FABP的表达水平则呈负相关关系。关于E－FABP在胰腺癌肝转移中的作用机制尚待进一步探讨研究。

二磷酸核苷激酶B是nm23基因编码的产物，nm23基因家族是一类与肿瘤细胞转移潜能有关的肿瘤转移抑制基因，其表达与肿瘤转移呈负相关，对肿瘤转移起抑制作用，其主要通过参与微观蛋白的聚合和调节G蛋白介导的信号传递，从而发挥对肿瘤细胞增殖、迁移的负性调节来实现抑制肿瘤转移的作用［13］，本研究发现二磷酸核苷激酶B在高肝转移L3.6 pl细胞分泌蛋白质中的表达水平显著低于低肝转移Colo－357细胞，提示二磷酸核苷激酶B可能作为胰腺癌肝转移的负性调节因子发挥抑制胰腺癌肝转移的作用。

本研究将双向凝胶电泳、质谱分析等蛋白质组学技术引入胰腺癌定向肝转移方面的研究中，筛选出了部分胰腺癌肝转移相关分泌蛋白，这些蛋白涉及肿瘤细胞的生长、增殖、黏附、运动、凋亡等功能相关事件，但由于蛋白组学技术本身存在的局限性，本研究结果尚需进一步的验证，以证实这些差异表达的蛋白质在胰腺癌肝转移中的作用。

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