鼻咽癌细胞鸡胚绒毛尿囊膜移植瘤模型的建立△

李 萍 张 哲 韦祝新 张锦艳

(1广西医科大学基础医学院,南宁市 530021;2广西医科大学第一附属医院,南宁市 530021)

鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma,NPC)在中国两广地区高发,60%～70%的患者就诊时已是Ⅲ、Ⅳ期,中晚期患者因较高的局部复发率和转移率导致总生存率偏低[1]。鼻咽癌的临床标本获取比较有限,这对开展鼻咽癌生物学行为的研究极为不利。目前常用的鼻咽癌动物模型是裸鼠移植肿瘤模型,该模型实验条件要求高,且实验周期长,费用昂贵。鸡胚尿囊膜模型是最近开发的移植瘤模型之一,具有简单、方便、价廉、快速等优点,国内外已有学者把该项技术应用于黑色素瘤[2]、神经母细胞瘤[3]、子宫内膜腺癌[4]等肿瘤的研究。但用于鼻咽癌研究的尚未见报道。本课题旨在研究鼻咽癌鸡胚绒毛尿囊膜(chorioallantoic membrane,CAM)模型的建立,为今后进一步开展有关鼻咽癌的研究创建技术平台。

1 材料与方法

1.1 材料 鼻咽癌细胞株 5-8F购自中南大学湘雅医学院中心实验室细胞库 。受精种蛋购自南宁市良凤农牧有限责任公司(原南宁市养鸡厂),为良凤花鸡鸡种。

1.2 方法 制作鸡胚模型的方法:8日龄鸡胚在照卵器照射下用铅笔在蛋壳表面勾画出气室、胚体及 CAM上大血管位置;于超净工作台上用转孔器在蛋壳表面“开窗”,对数生长期鼻咽癌细胞悬液滴加于CAM,无菌透明辅料封闭方窗;胚蛋放回孵箱继续孵育。在此基础上,分别接种 0.25×106、0.5×106、1×106、2×106个 NPC细胞及对照组(IMDM培养基)于鸡胚,从孵育 24 h起,每隔 24 h对胚蛋进行原位数码摄影。共孵育 120h,分离移植瘤瘤体,测量其直径及厚度,计算肿瘤体积,并行组织切片HE染色。

1.3 统计学处理 应用 SPSS 12.0软件进行处理。两样本均数检验采用独立样本 t检验,以 P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 NPC细胞CAM模型最佳接种条件的确定 根据鸡胚孵化的特点,确定最佳的接种时间为鸡胚孵至第 8日龄,终止时间为鸡胚孵至第 14日龄。以“开窗法”为鼻咽癌的最佳接种CAM的方法,以硅胶圈为最佳的接种癌细胞的载体。按照以上接种条件,我们对接种NPC细胞的胚蛋进行原位数码摄影。从图1中可以看到,接种 72 h后,在鸡胚 CAM膜上已出现了明显的瘤体,瘤体稍隆起于 CAM膜,边界清楚,周围 CAM膜变粗糙,并可见小血管以瘤体为中心放射状的生长。对照组中未见移植瘤生长。HE染色切片可见,鼻咽癌细胞以 CAM膜为细胞外基质生长,形成癌巢;癌细胞大小不一,核浆比例升高,核染色深,核仁清楚,病理性核分裂像多见(3～8个/高倍视野),呈明显的低分化癌的特征(见图2)。这些均符合鼻咽癌体内生长的模式。

图1 大体形态观察 0.5×106个鼻咽癌细胞接种 CAM 72 h移植瘤的生长

2.2 适宜接种细胞数目的确定

2.2.1 确定 NPC细胞在CAM成瘤的最小接种数目 以肿瘤直径达到或超过 2mm为成瘤阳性。从表1可见,接种细胞数为 0.25×106时,虽有移植瘤形成,但成瘤率未达到 100%;而接种细胞数达到或超过 0.5×106时,成瘤率达到了 100%。因此,NPC细胞在 CAM成瘤的最小接种细胞数为 0.25×106。

表1 在 CAM上接种不同细胞数鼻咽癌细胞后移植瘤成瘤情况

2.2.2 确定 NPC细胞在CAM成瘤的适宜接种细胞数 从表2及图3中可以看出,当接种细胞数较小时,即 0.25×106和0.5×106,形成的移植瘤体积较小;当接种细胞数达到 1×106时,移植瘤的体积显著增大(P<0.05)。当接种数量达到 2×106个细胞时,移植瘤体积还有所增大。但同时移植瘤中心出现明显的坏死,这一点经切片观察也得到证实。故鼻咽癌细胞在 CAM上的适宜成瘤接种细胞数是 0.5×106～1×106。

图2 鼻咽癌细胞接种 CAM膜组织HE切片观察(HE 40×10)

表2 CAM上接种不同细胞数鼻咽癌细胞 120 h移植瘤体积

图3 CAM上接种不同细胞数鼻咽癌细胞 120 h后移植瘤瘤体观察

3 讨 论

近代,鸡胚材料在多个研究领域和方向被大量的应用,主要原因是鸡胚的免疫力低,适合异种细胞的生长。此外,鸡胚具有简便、经济、实验周期短、不需要特殊设备的特点,因此在一般实验室即可开展。目前鸡胚已经普遍应用于发育学[5]、病毒学[6]、寄生虫学(如原虫[7]),以及一些肿瘤和非肿瘤性疾病(如子宫内膜异位症[8])的研究中。而在所有应用鸡胚材料的实验中,CAM在肿瘤学方面的研究,是其中的一个热点。

鸡胚的发育期是 20～21 d,在鸡胚尿囊发育过程中,尿囊体壁中胚层与绒毛膜脏壁中胚层融合形成绒毛尿囊膜 CAM。绒毛尿囊膜与外方的多孔外壳紧贴的特点以及其中丰富的毛细血管丛,保证了最高水平的气体和营养交换,这使得绒毛尿囊膜成为鸡胚的重要呼吸器官。同时也因这一特点使它能有效地支持组织移植物的生长,这些均使鸡胚绒毛尿囊膜成为研究肿瘤的良好动物模型。

为了建立好鼻咽癌鸡胚绒毛尿囊膜模型,我们对模型制作手法和接种条件进行了优化。首先是制作方法的选择,常用的建立鸡胚尿囊膜模型的方法有两种:无壳法和窗法。无壳法是 Auerbach教授于1974年创立的[9],国外许多学者提倡使用此方法,认为它易于动态观察。我们发现无壳法培养鸡胚死亡率较高,且在南方的潮湿环境下鸡胚易于感染。而窗法有相对易于操作、成瘤率高等优点,因此确立了使用窗法作为模型建立的方法。经过反复摸索,我们掌握了给鸡胚“开窗”的最佳方法,使鸡胚“开窗”成功率接近 100%。其次在载体的选择方面,由于在已建立的各种肿瘤鸡胚 CAM模型中,对于载体的使用没有统一的标准,我们尝试了文献报道的多种载体,包括甲基纤维素膜、明胶海绵、硅胶圈和无载体细胞悬液直接滴注等方法。经过大量实验摸索,我们认为对于一定量内的癌细胞接种,以硅胶圈法最为理想,其可通过限定一定的接种表面积及体积保证实验的同一性。然而对于活检的原代组织的接种,直接接种是较好的方法。在接种时间的选择上,由于鸡胚发育的特点是:在孵育的第 6天,尿囊急剧增大与浆膜相贴愈合,形成尿囊绒毛膜;至孵育的第 8天,尿囊较第 7天扩大了一倍,几乎包围了卵黄囊。因此我们选择的接种时间是鸡胚孵至 8日龄时。根据鸡胚免疫器官发育的特点:孵化到第 2周时,鸡胚胸腺中的淋巴细胞就可出现宿主抗移植物反应[10],故此我们选择的实验终止时间是最迟至鸡胚孵育的第 14日龄。经过对实验手法的摸索,我们接种鼻咽癌细胞于 CAM膜上,成功地使之在CAM上形成移植瘤。通过原位摄影,我们观察了移植瘤出现、形成和发展的过程。显微镜下,癌细胞侵袭浸润 CAM膜;CAM膜内的癌细胞排列方式恢复为与人体内一致的巢状结构,同时癌细胞保持低分化癌的形态,充分说明鼻咽癌CAM移植瘤可模拟鼻咽癌人体内生长模式。

除了对以上条件进行摸索和优化,我们进一步还要优化癌细胞的接种数,以确保成瘤率及肿瘤的有效生长。不同的肿瘤细胞 CAM膜移植成瘤能力不同。有资料表明,前列腺癌细胞株[11]、黑色素瘤细胞株[12]接种细胞数在 105～106之间就可有较好的肿瘤组织形成能力。而卵巢癌细胞须在细胞数达到 107～108时才能形成移植瘤[13]。我们发现当接种鼻咽癌细胞数在 0.25×106时虽可成瘤,但成瘤率未达 100%;当接种细胞数在 0.5×106及以上时,成瘤率方达 100%。此外,接种 0.25×106个鼻咽癌细胞时,形成的移植瘤体积较小。随着接种细胞数目的增加,形成移植瘤的体积有所增大。能引起移植瘤体积显著增加的接种细胞数为 1×106。而当接种细胞数增加至 2×106时移植瘤中心出现明显坏死。从以上结果可以看出,人鼻咽癌细胞株的适宜接种细胞数为 0.5～1×106个细胞/只鸡胚。

我们摸索出了建立鼻咽癌细胞CAM移植瘤的成熟条件,成功地建立了鼻咽癌CAM移植瘤模型,为开展鼻咽癌的生物学行为研究奠定了又一个技术平台,对防治鼻咽癌的工作具有重要意义。

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